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慢性持续性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是我国肝癌发生的主要病因,清除HBV感染性肝细胞有可能阻断肝癌的发生进程。抗病毒疗法是现阶段临床治疗HBV感染的主要手段,并已在部分患者中证明能有效控制病毒复制,但却不能完全清除病毒。含有HBV抗原的治疗性疫苗可打破慢性感染者体内对病原体的免疫耐受,增强或重建机体针对HBV抗原的免疫应答反应,有望成为治愈慢性HBV感染的有效手段。Toll样受体(TLRs)配体能通过与相应TLRs结合而激活免疫细胞,调节适应性免疫反应的强度或改变反应的类型,现已用于抵御人类疾病疫苗的佐剂研发中。我们已有的工作表明：HBV表面抗原(HBsAg)与TLR7/8受体激动剂CL097的偶联可促进外周血单核细胞(Mo)在组织中成熟分化为树突状细胞(DC),相对于铝盐佐剂,在小鼠体内可诱导出更强的抗HBsAg应答。乙肝核心抗原(HBcAg)是乙肝治疗性疫苗研发过程中的一个重要抗原,其特异性T细胞的存在和慢性HBV感染的清除有关。TLR7/8激动剂与目的抗原的偶联能更好的进行抗原交叉提呈,诱导抗原特异性的Th1型免疫应答及CD8+T细胞的产生。本研究中,采用氢氧化铝盐吸附制备了含有5μgTLR7/8激动剂CL097和5μ.gHBsAg及5μg HBcAg的含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗(HBV-Ag+Alum+CL097),采用UPLC-Q-TOF-MS高分辨串联质谱分析证实：TLR7/8激动剂CL097通过表面电荷效应能有效被铝盐吸附,与共同吸附的HBsAg及HBcAg抗原抗原形成物理性连接的颗粒性抗原。将抗原进行FITC荧光标记后,通过铝盐吸附,注射到C57BL/6J小鼠皮内,48小时后收集局部引流淋巴结发现：加入CL097后,引流淋巴结中含有更多的标记抗原,表明在疫苗中加入CL097可以促进更多携带外周抗原信息的DC回巢到淋巴结中。进而,我们分离分析了摄取标记抗原的细胞群体,结果显示：摄取疫苗性抗原的细胞主要是CDllb阳性细胞(≥90%),而非CD11c阳性细胞(<10%)；CL097加入后,摄取抗原的CD11c阳性细胞比例有所增加,但主要仍是CDllb阳性细胞。在CDllb阳性细胞群体中,其中一大部分细胞高表达Ly6c,一部分低表达或不表达Ly6c分子。免疫分选上述两群细胞后转输到小鼠皮内,结果发现这两群细胞在体内均可分化成为能够回巢到局部引流淋巴结的CDllc+细胞。随后,我们分离小鼠脾脏Ly6c+细胞,用该疫苗进行刺激,发现与单纯采用铝佐剂的疫苗抗原相比,其能显著促进Mo向DC分化成熟,上调CCR7表达,促进细胞产生和分泌IL-6和TNF-α。上述刺激分化后的Mo在与初始T (naive T)细胞共培养后,能促进这种T细胞表达更高水平的BCL-6和T-beta转录因子,表现为滤泡辅助性T细胞的表型特征,细胞表面高表达CXCR5,分泌产生IL-21、IFN-γ及TNF-α。为此,我们采用2株不同来源的HBV转基因小鼠模拟人体的慢性HBV感染状态,进行疫苗的皮下免疫注射,观察含有CL097的HBV疫苗的治疗作用,每2周免疫1次,共4次。结果发现：含有CL097通过铝盐吸附的HBV抗原在4次免疫后,54.5%(6/11)的小鼠中可检测到HBsAg特异性抗体(抗HBs),抗体含量为85.88mIU/ml;抗体在第4次免疫20周后仍可检测到,并且在加强免疫一周后迅速升高。ELISPOT检测结果显示免疫小鼠体内产生了HBsAg特异性B细胞。流式分析发现小鼠脾脏淋巴细胞中有CD4+IFN-γ+T、CD8+IFN-γ+T及IL-21+T细胞生成。以上结果提示：该疫苗免疫在HBV转基因小鼠体内可有效诱导针对HBsAg的体液及细胞免疫应答。随后,我们分选到经上述疫苗免疫后的HBV转基因小鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)和Treg清除后脾细胞,转输到未处理的正常C57BL/6J小鼠体内,采用5μg HBsAg免疫3天后即可检测到特异性的抗HBs产生,表明该疫苗在HBV转基因小鼠中有效诱导出抗原特异性的记忆性B淋巴细胞；在转输CD4+CD25+的Treg细胞后,采用5μg HBsAg免疫12天后可检测有特异性抗体产生。而在未免疫的正常C57BL/6J小鼠体内转输未免疫的HBV转基因小鼠的CD4+CD25-细胞和CD4+CD25+调节性T细胞后,采用5μgHBsAg免疫后均未检测到有抗HBs产生。由此表明,含有TLR7/8激动剂的HBV抗原疫苗能打破机体特异性免疫耐受状态,促进抗原特异性免疫应答的产生。同时,我们也考察了该疫苗联合使用外源性Ⅰ型干扰素IFN-α-2b在HBV转基因小鼠中的治疗效果,结果发现两者联合使用后抗HBs的产生提前,这为慢性HBV感染的治疗提供了一种新疗法。此外,我们利用高成瘤性黑色素瘤细胞系B16建立了表达HBV相关抗原的种植性肝脏肿瘤小鼠模型,采用上述疫苗免疫3次后,肝脏原位接种上述肿瘤细胞。结果发现该疫苗免疫后能在正常C57BL/6J小鼠中有效诱导出较强的体液及T细胞免疫应答。接种肿瘤细胞后,荷瘤小鼠中位生存时间相对于常规预防性乙肝疫苗免疫组延长了5天,同时1/7小鼠实现了治愈,并可在体内检测到大量抗原特异性的IFN-γ分泌型T细胞。通过上述研究,我们获得如下结果：1、TLR7/8激动剂CL097通过表面电荷效应能有效被铝盐吸附,与共同吸附的HBsAg及HBcAg抗原形成物理性连接的颗粒性抗原；该疫苗抗原在皮下注射后,主要被CD11b阳性的单核吞噬细胞所摄取,并能促进其分化成熟,携带相应的抗原信息回巢到局部引流淋巴结。2、经含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗作用后的单核细胞源性的树突状细胞能促进初始T细胞分化为表达CXCR5, IL-21产生型的滤泡性辅助T细胞。3、含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗能在HBV转基因小鼠(模拟人类慢性乙型肝炎感染状态)中能打破机体特异性免疫耐受状态,促进抗原特异性免疫应答的产生。联合使用外源性Ⅰ型干扰素IFN-α-2b使用后抗HBs的产生提前,为慢性HBV感染的治疗提供了一种新疗法。4、含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗在正常C57BL/6J小鼠中有效诱导出较强的体液及T细胞免疫应答,并能减缓表达HBV抗原的肿瘤细胞在肝脏上的生长。