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研究背景自噬(autophagy)是真核细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解自身受损细胞器和大分子物质的过程,是细胞维持稳态的重要机制。根据自噬靶标的不同,自噬可分为:内质网自噬、线粒体自噬、核糖体自噬及细胞核自噬等。细胞核自噬是选择性降解细胞核内容物的特殊自噬过程,通过清除受损细胞核膜及核内物质,细胞核自噬可以维持细胞内基因组的稳定性,但是过度的细胞核自噬最终也可导致细胞死亡。目前大多数报道集中于胞浆内物质的自噬,关于降解细胞核内容物的报道较少。研究表明细胞核自噬在癌症治疗中的生理病理过程具有重要意义。天然药物通常具有高效、低毒的特点,可有效抑制、杀伤肿瘤细胞。目前关于天然药物抗肿瘤的作用机制尚未完全明确,在一定程度上限制了天然药物的开发与应用。本文我们通过阐明细胞核自噬新的分子调节机制,在理论上为天然抗肿瘤药物的开发提供了重要依据。研究方法选择人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞作为体外研究对象。采用免疫印迹法(western blot)检测细胞核受损标志物p-H2AX的表达,通过激光共聚焦(confocal)观察细胞核的溢裂情况及细胞核自噬现象。采用免疫沉淀(immunoprecipitation)和免疫荧光(immunofluorescence)的方法检测LC3与lamin A/C的相互作用和共定位情况。通过siRNA干扰技术、免疫沉淀和免疫荧光实验,探究UBC9的表达对lamin A/C的SUMO化修饰程度及细胞核自噬水平的影响。研究结果1.多柔比星诱导细胞核溢裂和细胞核自噬多柔比星(DOX)可引起乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞p-H2AX表达升高,同时可观察到部分细胞核溢裂。进一步通过免疫印迹法检测到在细胞核蛋白和全细胞蛋白中,多柔比星可引起LC3B-II表达水平升高,SQSTM1/P62表达水平降低。通过激光共聚焦,我们观察到多柔比星可引起细胞自噬体数量增多,且溢裂的细胞核被自噬体荧光包裹,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,表明多柔比星引起的细胞核溢裂可诱导细胞核自噬的产生。同时在其他癌症细胞(如肝癌细胞、前列腺癌细胞和肺癌细胞)中也观察到多柔比星诱导细胞核自噬的现象。2.LC3与lamin A/C相互作用在细胞核自噬中的重要作用多柔比星处理乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞后,细胞核蛋白中lamin A/C的表达降低。通过免疫荧光实验,发现多柔比星引起的细胞核溢裂部分可与lamin A/C发生共定位,表明lamin A/C的降解有助于细胞核溢裂。通过免疫沉淀技术,发现多柔比星可增加LC3与lamin A/C之间的结合,同时通过免疫荧光实验,我们观察到LC3与lamin A/C之间产生共定位,且细胞核的溢裂部分与LC3的红色荧光、lamin A/C信号和溶酶体绿色荧光产生共定位。上述结果表明,LC3与lamin A/C相互作用可能在多柔比星诱导细胞核自噬的过程中发挥重要的作用。3.Lamin A/C的SUMO化修饰促进LC3与lamin A/C相互作用多柔比星可以引起细胞核蛋白中SUMO1与lamin A/C的结合增加,通过免疫荧光实验,发现lamin A/C与SUMO1、LC3的绿色荧光和细胞核的溢裂部分产生共定位。结果表明,lamin A/C的SUMO化修饰可促进LC3与lamin A/C的相互作用。4.细胞核内UBC9蛋白的聚集促进lamin A/C的SUMO化修饰通过蛋白质组学分析,我们发现多柔比星可使乳腺癌MDA-MB-231细胞核中UBC9的表达升高。通过免疫印迹法进一步证实了在细胞核蛋白和全细胞蛋白水平上UBC9的表达均增加。通过免疫荧光实验,我们观察到UBC9主要在细胞核内聚集。通过免疫荧光和免疫沉淀实验,我们发现UBC9通过与lamin A/C的结合可以使SUMO1与lamin A/C的结合及共定位增强。上述结果表明,UBC9在细胞核内的聚集可以促进lamin A/C的SUMO化修饰。5.敲降UBC9可阻断多柔比星诱导lamin A/C的SUMO化修饰和细胞核自噬水平通过siRNA技术干扰UBC9的表达,发现敲降UBC9可阻断多柔比星引起lamin A/C的SUMO化修饰,从而减弱LC3与lamin A/C的相互作用,最终抑制细胞核自噬的产生。6.天然药物诱导肿瘤细胞核自噬形成采用天然药物异硫氰酸苄酯(Benzyl isothiocyanate,BITC)和雷公藤甲素(Triptolide,TPL)分别处理乳腺癌MDA-MB-231、肺癌A549细胞。通过免疫印迹检测到BITC和TPL可使乳腺癌、肺癌细胞p-H2AX表达升高,通过激光共聚焦观察到BITC和TPL可使乳腺癌、肺癌细胞核溢裂。通过免疫印迹检测到细胞核蛋白中LC3B-II表达升高,lamin A/C表达降低。最后通过激光共聚焦观察到,BITC和TPL能使乳腺癌、肺癌细胞核自噬形成。研究结论多柔比星可通过UBC9在细胞核中的聚集促进lamin A/C的SUMO化修饰,进而使LC3与lamin A/C的相互作用增强,导致细胞核溢裂,最终导致细胞核自噬的产生。天然药物异硫氰酸苄酯(BITC)和雷公藤甲素(TPL)能使不同肿瘤细胞产生细胞核自噬。