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肝脏是人体内唯一具有强大再生能力的实质性器官。各种物理、化学、生物等因素均可导致肝脏疾病的发生。如果不及时治疗可能会进一步导致肝纤维化、肝硬化乃至肝癌。肝再生能力不足是晚期肝病的一个共同特征,因此深入探究肝再生的分子机制对于提高患者的总体生存率具有非常重要的临床意义。M型瞬时受体电位通道7(transient receptor potential melastatin 7,TRPM7)是一种具有离子通道和激酶双功能的膜蛋白,参与调节多种生理功能和病理进程。课题组前期研究发现TRPM7参与肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)的活化和增殖,而在肝再生及肝实质细胞增殖中的作用未被报道和研究。现通过经典的70%肝切除术(partial hepatectomy,PHx)肝再生模型探讨TRPM7是否参与肝再生。为探究TRPM7参与肝实质细胞增殖的分子机制,分别选用人源性的L-02细胞株及鼠源性的AML-12细胞株进行体外实验,观察TRPM7对于肝实质细胞增殖的影响及其机制。本研究可划分为以下三个部分。1.PHx术后肝再生过程中TRPM7的蛋白表达变化TRPM7作为具有离子通道和激酶双功能的膜蛋白,已经被证实参与多种细胞增殖等生物学过程。但在肝再生过程中的表达变化尚未被报道。本研究采用western blot法分析了PHx术后肝再生过程中TRPM7的蛋白表达变化。结果显示TRPM7的蛋白水平在PHx术后上升并且在24h时达到高峰,且与细胞增殖指标蛋白PCNA表达变化具有一致性。2.TRPM7对L-02、AML-12细胞增殖及周期的影响采用不同浓度(0、25、50、100、200、400μM)和不同时间点(0、3、6、12、24、48h)的2-APB对L-02、AML-12细胞进行处理,MTT、集落形成实验结果确定2-APB作用的最佳条件;给予2-APB(100μM)作用于L-02、AML-12细胞24h后,western blot法检测TRPM7、PCNA、Cyclin D1、CDK4、STAT3、p-STAT3蛋白变化;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果提示:2-APB在体外抑制L-02、AML-12细胞活力具有时间及浓度依赖性。给予2-APB(100μM)作用24h时可下调细胞中TRPM7、PCNA、Cyclin D1、CDK4、STAT3、p-STAT3蛋白量;同时流式结果表明2-APB分别阻滞L-02、AML-12细胞于S期及G1期。为了排除抑制剂的非特异性作用,使用TRPM7的特异性si RNA下调L-02细胞中TRPM7的表达,western blot法检测细胞中TRPM7沉默水平并检测PCNA、Cyclin D1、CDK4表达水平;结果表明成功沉默TRPM7可下降L-02细胞中Cyclin D1、CDK4、PCNA蛋白的表达量。3.STAT3信号通路在L-02、AML-12细胞增殖的作用采用不同浓度(0、6.25、12.5、25、50、100μM)和不同时间点(0、3、6、12、24、48h)的S3I201对于L-02、AML-12细胞进行处理,MTT、集落形成实验结果确定S3I201作用的最佳条件;给予S3I201(50μM)作用于L-02、AML-12细胞24h后,western blot检测STAT3、p-STAT3蛋白变化;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果提示:S3I201在体外抑制L-02、AML-12细胞活力具有时间及浓度依赖性。其中S3I201(50μM)作用24h时下调细胞中的p-STAT3蛋白量而对STAT3总蛋白不产生影响。同时流式结果表明S3I201可以阻滞L-02、AML-12细胞于S期。