【摘 要】
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目的:梅毒是梅毒螺旋体（Tp）感染引起的慢性、系统性的性传播疾病。巨噬细胞作为机体免疫反应的始动者和执行者,是宿主清除梅毒螺旋体最主要的效应细胞。自噬和吞噬作为巨噬细胞内固有的两种功能,在病原体感染过程中发挥重要作用,但其在Tp感染中的作用机制尚未明确。本论文拟明确Tp作用后巨噬细胞自噬和吞噬能力变化,分析自噬对巨噬细胞吞噬和杀伤Tp的影响,并进一步探讨NLRP3炎性复合体对巨噬细胞自噬和吞噬功能
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目的:梅毒是梅毒螺旋体（Tp）感染引起的慢性、系统性的性传播疾病。巨噬细胞作为机体免疫反应的始动者和执行者,是宿主清除梅毒螺旋体最主要的效应细胞。自噬和吞噬作为巨噬细胞内固有的两种功能,在病原体感染过程中发挥重要作用,但其在Tp感染中的作用机制尚未明确。本论文拟明确Tp作用后巨噬细胞自噬和吞噬能力变化,分析自噬对巨噬细胞吞噬和杀伤Tp的影响,并进一步探讨NLRP3炎性复合体对巨噬细胞自噬和吞噬功能的调控作用。方法:以感染复数（Multip l icity of infection,MOI）为 10:1、20:1、50:1 或 100:1的Tp和THP-1来源的巨噬细胞共培养12 h,分别采用RT-PCR和蛋白印迹法检测Tp作用后巨噬细胞的自噬相关基因beclin1和LC3B的mRNA和蛋白的表达以及巨噬细胞表面吞噬受体Fcγ受体（FR）和清道夫受体（SR）的mRNA水平,并采用间接免疫荧光测定Tp 阳性的巨噬细胞百分比和内化螺旋体的平均荧光强度（MFI）,设定PBS作用后的巨噬细胞为对照组,明确巨噬细胞对Tp的吞噬作用。将MOI为20:1的Tp和巨噬细胞分别孵育0、1、2、4、6、8、12和24 h,分析上述指标随时间的变化。通过转染si-Beclin1抑制细胞自噬水平,分析转染后巨噬细胞表面吞噬受体水平和细胞吞噬功能的变化,设定未转染的巨噬细胞为空白对照组,转染空白质粒si-NC的细胞为si-NC组;并采用兔感染实验明确自噬对巨噬细胞杀伤细胞内Tp能力的影响。随后,转染si-NLRP3抑制细胞内NLRP3水平,分析转染后自噬和吞噬功能的变化,探究NLRP3对巨噬细胞自噬和吞噬功能的调控作用,设定未转染的巨噬细胞为空白对照组,转染空白质粒si-NC的细胞为si-NC组。结果:Tp作用可增强巨噬细胞自噬,呈现浓度和依赖性表达的方式。自噬相关基因beclin1和LC3B的mRNA和蛋白水平在MOI为20:1时明显增加（与PBS组相比,P<0.05）,MOI为100:1时达到最大（与PBS组相比,P<0.05）;两者mRNA和蛋白水平随时间增加不断增加,在12h达到最大水平（与0h相比,P<0.05）。同时,间接免疫荧光结果表明Tp 阳性的巨噬细胞百分比和内化螺旋体的MFI呈浓度和时间依赖性的方式,MOI为10:1,两者即明显增加（与PBS组相比,P<0.001）,MOI为100:1时达到最大值（与PBS组相比,P<0.001）;MOI为20:1的Tp与细胞孵育1h,两者水平即显著增加（与0h相比,P<0.001）,并分别在12h和24h达到最大值（与0h组相比,P<0.001）。si-Beclin1抑制细胞自噬后,巨噬细胞表面吞噬受体FR和SR的水平分别降为40.19%和43.60%（与对照组相比,P<0.001）,Tp阳性的巨噬细胞百分比（70.93%与22.34%,P<0.001）和内化螺旋体的MFI（20.33与9.62,P<0.001）也明显下降。兔感染实验证实自噬水平下降,巨噬细胞对Tp的杀伤能力明显降低,感染兔皮损出现时间提前3.00天（14.55±1.99 天与 17.55±3.73 天）,皮损数量明显增多（66.7%（20/30）与 36.7%（11/30）,χ2=5.406,P=0.020）。此外,抑制NLRP3 水平后,自噬相关基因beclin1、LC3B 的mRNA 和蛋白水平分别降为 49.86%、43.02%和 22.31%、24.24%,Tp阳性的巨噬细胞百分比（30.29%与70.53%,P<0.001）和内化螺旋体的MFI（9.82和19.33,P<0.001）也明显下降。结论:Tp作用可增强巨噬细胞自噬和吞噬受体的表达,促进巨噬细胞对Tp的吞噬作用;自噬水平降低可减弱巨噬细胞对Tp的吞噬与杀伤作用;NLRP3炎性复合体可调控自噬和巨噬细胞对Tp的吞噬作用。
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