论文部分内容阅读
哮喘发病的核心机制是Th1/Th2细胞因子比例的降低,而Th1细胞因子与Th2细胞因子之间存在交互抑制作用,故抑制对Th2细胞因子表达具有促进作用的转录因子GATA-3,或刺激对Th1细胞因子表达具有促进作用的转录因子T-bet,被认为是纠正哮喘T淋巴细胞(T细胞)因子失衡的有效途径。前期研究发现了一个可抑制GATA-3功能的转录因子ROG(Repressor of GATA-3),在其高表达的CD4~+T细胞,Th1细胞因子和Th2细胞因子的表达均受到抑制,但机制不明。阐明ROG负向调控T细胞因子表达的确切机制,对于明确哮喘T细胞因子失衡机理,具有重要意义。ROG是一种淋巴细胞特异性基因,所表达的蛋白是抑制性锌指转录因子家族的一个新成员。初期研究发现,在初始CD4~+T细胞受到抗CD3刺激后的早期,ROG即可迅速表达,并可明显抑制GATA-3诱导的反式激活,完全抑制GATA-3对IL-4和IL-5启动子的激活,因此命名为GATA-3抑制因子;深入研究发现,在对CD4~+T细胞转染ROG基因后,Th1、Th2细胞因子的表达量均明显下降。ROG抑制Th2细胞因子的表达可能是部分或者完全通过其对GATA-3的抑制所实现,但其抑制Th1细胞因子的途径,尚不得而知。除GATA-3外,ROG的下游应该另有负向调控T细胞因子表达的靶点。基于目前对T细胞因子表达调控机制的研究进展,ROG调控T细胞因子表达的可能靶点包括:T细胞膜上的CD3分子(T细胞胞膜第一信号)、T细胞膜上的共刺激信号分子如CD28、可诱导T细胞共刺激分子(Inducible T cellcostimulator,ICOS)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T-LymphocyteAntigen 4,CTLA-4)等(T细胞胞膜第二信号)、胞浆内信号转导通路分子CD45等(T细胞胞浆内信号)。在对这些信号分子的特点进行分析后,我们提出以下假设:ROG是通过直接或间接抑制CD3、CD28、ICOS等对T细胞因子表达具有刺激作用的分子,或通过间接刺激CTLA-4、CD45等对T细胞因子表达具有抑制作用的分子,从而抑制T细胞因子的表达。为了验证以上假设,并揭示相关的机制,我们设计了以下研究方案:首先,以荧光定量PCR和Western Blot分别了解初始状态的Th1、Th2细胞中ROG及CD3、CD28、ICON、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的基础表达状况,并以ELISA分别检测Th1、Th2细胞培养液中IFN-γ、IL-4的表达状况;其次,以ROG-pcDNA3.1分别转染Th1、Th2细胞,诱导Th1、Th2细胞中的ROG表达上调,分别采用荧光定量PCR和Western Blot方法观察Th1、Th2细胞中CD3、CD28、ICON、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的表达变化情况,并以ELISA分别检测Th1、Th2细胞培养液中IFN-γ、IL-4的表达状况;最后,以ROG-siRNA分别转染Th1、Th2细胞,诱导Th1、Th2细胞中的ROG表达下调,分别采用荧光定量PCR和Western Blot方法观察Th1、Th2细胞中CD3、CD28、ICON、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的表达变化情况,并以ELISA分别检测Th1、Th2细胞培养液中IFN-γ、IL-4的表达状况。结果显示,在初始状态的Th1、Th2细胞中,ROG的表达水平较低(P＜0.01)。与初始状态的Th1、Th2细胞相比,经ROG基因转染的Th1、Th2细胞中,ROG的表达量显著升高(P＜0.01),伴随ICOS的表达量显著降低(P＜0.01),而CD3、CD28、CTLA-4、CD45的表达状况无显著性改变(P＞0.05);与初始Th1细胞的培养液相比,经ROG基因转染的Th1细胞的培养液中,IFN-γ的表达量显著降低(P＜0.01),而与初始Th2细胞的培养液相比,经ROG基因转染的Th2细胞的培养液中,IL-4的表达量显著降低(P＜0.01)。与初始状态的Th1、Th2细胞相比,经ROG基因表达沉默的Th1、Th2细胞中,ROG的表达量显著降低(P＜0.01),伴随ICON的表达量显著升高(P＜0.01),而CD3、CD28、CTLA-4、CD45的表达状况无显著性改变(P＞0.05);与初始Th1细胞的培养液相比,经ROG基因表达沉默的Th1细胞的培养液中,IFN-γ的表达量显著升高(P＜0.01),而与初始Th2细胞的培养液相比,经ROG基因表达沉默的Th2细胞的培养液中,IL-4的表达量显著升高(P＜0.01)。由以上实验结果可知,ROG表达上调可通过抑制ICON表达而抑制T细胞因子表达,ROG表达下调可通过促进ICON表达而促进T细胞因子表达,即ROG可通过负调控ICON的表达而负调控T细胞因子的表达。通过生物信息学研究发现,在ICOS的启动子区包含有GATA-1区,而后者与GATA-3具有76%的同源性,且GATA-1和GATA-3都是对基因转录具有重要启动作用的转录因子,因此,推测ROG对ICOS表达的抑制作用是通过其对GATA-1的抑制作用而间接导致。本研究丰富了ROG调控T细胞因子表达的相关理论,为揭示哮喘T细胞因子失衡机理、探索哮喘基因治疗靶点提供了新的理论和实验依据。