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研究背景与目的:慢性移植物抗宿主病(Chronic graft versus host disease,cGVHD)是一种表现为多器官、多组织慢性炎症和纤维化样病理损伤,临床表现为类似自身免疫性疾病样的综合症,是异基因造血干细胞移植(allogeneic hemapoietic stem cells transplantation,allo-HSCT)后主要严重并发症和非复发死亡原因。随着allo-HSCT越来越多地用于年龄较大的患者,以及单倍体移植、供者淋巴细胞输注的不断增加,cGVHD的发生率呈上升趋势。尽管涌现了大量新型免疫抑制剂,但除皮质激素作为一线药物治疗外,其他药物疗效欠佳,难治型cGVHD的病死率仍高达50%。现有免疫抑制治疗手段以非选择性抑制T细胞或去除B细胞为主,非靶向治疗手段导致恶性肿瘤复发、严重感染、继发第二肿瘤以及cGVHD病情迁延反复,严重影响患者的生存质量。因此,深入探索cGVHD的发病机制,探索精确的靶向治疗模式,在移植免疫研究领域中具有重要的意义。人类cGVHD临床表现与系统性红斑狼疮、重症肌无力、干燥综合征等自身免疫性疾病类似,但其发病机制至今仍不明确,大量研究证明B细胞作为启动特异性T细胞免疫应答的抗原递呈细胞,又作为体液免疫的效应细胞,在cGVHD发生、发展中起着越来越重要作用。而B细胞活化及功能实施依赖于T细胞的辅助,最近研究发现,定位于淋巴滤泡,表达CXCR5、可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)分子、B 细胞淋巴瘤-6(B-cell CLL/lymphoma 6,Bcl-6)、PD-1 和 IL-21 的滤泡辅助性 T 细胞(Follicular Helper T cells,Tfh)是B细胞的主要辅助细胞,在启动体液免疫应答中发挥关键作用。微环境中的信号刺激(如IL-21)和STAT3活化加强了 Tfh细胞的B细胞辅助作用能力。无论是动物实验还是临床初步研究均证实Tfh细胞过度活化、相关分子表达异常可致浆细胞的抗体产生增加,抗体介导的体液免疫反应紊乱,引发自身免疫性疾病的发生。然而,Tfh在具有自身免疫性疾病特征的cGVHD中的作用如何?目前国内外研究甚少,Foster AD及Nguyen V等利用供鼠脾细胞输注,建立的狼疮样cGVHD小鼠模型中发现:CD4+T细胞的ICOS和IL-21高表达,与疾病的严重程度密切相关。大量研究表明,Bcl-6是调控初始T细胞分化为Tfh的关键转录因子,Naive初始CD4+T细胞分化为各功能亚群时,Bcl-6通过STAT3途径优先表达于Tfh,而不表达于Th1和Th2细胞,CXCR5的表达依赖于Bcl-6,缺乏Bcl-6的T细胞无法分化为Tfh细胞;Bcl-6可有效地保护前体B细胞在生发中心Ig亲和力成熟的过程免于凋亡,并能促使其分化为浆细胞,进而分泌抗体。动物研究证明,Bcl-6缺陷的小鼠,无法形成生发中心(germinal center,GC)或GC形成减少。我们前期发现:cGVHD患者在疾病进展时,CD19+CD5+B细胞↓/CD19+CD5-B↑细胞,随病情好转B细胞亚群紊乱获得恢复;而且,表达谱芯片发现Bcl-6调节因子STAT3及IL-21R在cGVHD患者中表达上调。Bcl-6基因是Tfh分化、增殖及功能实施的特异转录开关,也是形成生发中心B细胞的重要调节因子。结合最新研究进展及前期研究,我们提出特异性阻断Bcl-6,将是cGVHD防控的新靶点这一科学假说。本研究拟通过建立cGVHD小鼠模型,观察Bcl-6抑制剂79-6抗cGVHD的作用,探讨抑制Bcl-6抗cGVHD中的可能机制,为cGVHD靶向治疗提供实验依据。方法:1.建立一种能模拟人类cGVHD发生、发展的小鼠cGVHD模型。以BALB/C雌性小鼠为研究对象,分为空白对照组、移植对照组、放射对照组及cGVHD实验组。通过移植主要组织相容性抗原(MHC)相合、次要组织相容性抗原(miHA)不合的异基因B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞(8× 106,1:1)→BALB/C雌性小鼠,建立一种能模拟人类cGVHD发生、发展的小鼠cGVHD模型。移植前移植对照组、放射对照组及cGVHD实验组BALB/C小鼠经直线加速器700cGy的全身照射(TBI),移植对照组通过经尾静脉注射回输B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞(8×106),cGVHD实验组通过经尾静脉注射回输B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞(8×106,1:1)。移植后通过外周血白细胞计数观察小鼠造血重建情况,观察终点通过小鼠染色体分析验证受鼠植入情况。移植后前13天每天登记小鼠体重,移植后+14 d观察小鼠一般状态,包括体皮疹、脱毛、弓背、腹泻、运动、称重等,每3天进行一次临床评分,分析对比移植对照组及cGVHD实验组临床cGVHD评分。观察终点处死各组小鼠评估靶器官病理变化。2.以B10.D2→BALB/C cGVHD模型小鼠为研究对象,分为空白对照组、DMSO对照组(79-6溶剂)和BCL-6小分子抑制剂79-6(79-6+DMSO)治疗组三组。随机分配移植植入的小鼠至79-6治疗组、DMSO对照组、空白对照组,每组各5只。79-6治疗组:每只小鼠通过腹腔注射79-6药物剂量50mg/kg(注射体积根据小鼠体重10ul/1g),连续腹腔注射5天;DMSO对照组:每只小鼠通过腹腔注射10%DMSO溶液(注射体积根据小鼠体重10ul/1g),连续腹腔注射5天;空白对照组:每只小鼠通过腹腔注射PBS溶液(注射体积根据小鼠体重10ul/1g),连续腹腔注射5天。治疗前、治疗过程及治疗后临床观察:体重低于13g或到观察终点(移植后+65d)处死各组小鼠。观察终点进行以下实验:(1)进行器官、组织石蜡病理切片,用HE染色方法评估小鼠各靶器官cGVHD病变情况。(2)比较三组小鼠cGVHD临床评分、生存时间。(3)提取小鼠外周血RNA,用荧光定量PCR(染料法)检测目的基因Bcl-6的mRNA表达水平。(4)进行石蜡切片,用免疫组织化学染色方法检测小鼠脾脏生发中心IgG染色阳性细胞。(5)流式细胞术,检测各组小鼠脾脏细胞Tfh细胞(CD4+CXCR5+PD-1+)表达量。3.统计学分析:采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析。正态分布数据以均数±标准差(x±SD)描述。采用One-WayANOVA 比较多组间数据,采用Levene检验方差齐性;各组方差齐时,组间的比较选用可进行多个样本均数间两两均数比较的LSD。比较两组间数据,各组方差齐时,采用两样本t检验比较两组间均数。不同时间点连续测量的样本,采用重复测量设计的方差分析。Kapplan-Meier法分析小鼠生存时间。检验水准均为:α=0.05。结果:1.成功建立了 B10.D2→BALB/C MHC相合、miHA不相合cGVHD小鼠模型。移植后+10 d,空白对照组、移植对照组及cGVHD实验组小鼠全部存活,且WBC计数均>1×109/L,判定为造血恢复;放射对照组小鼠因造血功能衰竭全死亡,中位死亡时间为10 d;移植对照组及cGVHD实验组小鼠全部存活达到观察终点,且小鼠染色体均为供鼠型。cGVHD移植组cGVHD临床评分高于移植对照组,两组比较差异有统计学意义(F=53.59,P=0.00);cGVHD实验组小鼠移植后+20天皮肤临床评分均>0.6,皮肤、肝脏、肺等靶器官出现典型cGVHD的病理改变,病理评分明显高于对照组(P<0.05)。2.移植后+12天开始予Bcl-6小分子抑制剂79-6体内治疗cGVHD小鼠,移植后+14天左右,各组小鼠开始出现尾巴、爪部及双耳肿胀、脱皮、结痂,移植后+30天(药物治疗后+18天),空白对照组及DMSO对照组小鼠出现不同程度的尾巴、爪部及双耳肿胀、脱皮、结痂、溃疡和硬化,并出现颈项部、背部脱毛,而79-6治疗组小鼠颈项部、背部脱毛症状较轻;随着时间往后推移,79-6治疗组小鼠皮肤结痂、溃疡、脱毛、气促减轻,活力恢复、体重上升,空白对照组和DMSO对照组小鼠脱毛、皮肤结痂持续加重,活力差、体重减轻,气促重、弓背影响运动,cGVHD评分持续在较高水平,DMSO对照组小鼠在观察终点前已全部死亡或接近濒死期处死。(1)小鼠cGVHD临床评分重复测量方差分析结果显示:时间效应有统计学意义(F=3.559,P=0.006),说明小鼠cGVHD临床评分随时间呈现加重趋向;时间与干预交互效应也有统计学意义(F=2.361,P=0.043),79-6治疗组与两组对照小鼠的cGVHD临床评分随时间变化的趋势不同,79-6治疗组临床表现较轻。Kapplan-Meier生存分析显示:空白对照组小鼠预期平均生存时间为50±13.14天,DMSO对照组小鼠预期平均生存时间为44±3.29天,79-6治疗组小鼠预期平均生存时间为62±5.57天,DMSO对照组和79-6治疗组小鼠生存时间比较有统计学差异(t=3.771,P<0.05)。(2)空白对照组、DMSO对照组和79-6治疗组小鼠外周血Bcl-6 mRNA的相对表达量有显著性差异(F=23.40,P=0.000),79-6治疗组表达量低于DMSO对照组(t=5.89,P=0.001),且低于空白对照组,(t=5.431,P=0.002),差异均有统计学意义。(3)各组小鼠靶器官病理评分采用one-way ANOVA方差分析显示:各组之间病理总评分差异有统计学意义(F=5.57,P=0.027),79-6治疗组低于DMSO对照组(P<0.05),且低于空白对照组(P<0.05),差异均有统计学意义;根据靶器官的不同,分析提示各组皮肤病理评分差异有统计学意义(F=5.46,P=0.028),79-6治疗组皮肤病理评分明显低于空白对照组和DMSO对照组(P<0.05),79-6治疗组肺脏病理评分与两对照组比较无统计学差异(P>0.05),但显示出其治疗的优势性。(4)免疫组化IgG染色初步显示,空白对照组及DMSO对照组小鼠脾脏生发中心IgG染色阳性细胞胞浆密集;79-6治疗组生发中心IgG 阳性细胞数量明显减少。(5)各组小鼠脾脏Tfh细胞比例采用one-way ANOVA方差分析显示:各组之间脾脏Tfh 比例差异暂无统计学意义(P>0.05)。结论:1.成功建立了 B10.D2→BALB/C MHC相合、miHA不相合cGVHD小鼠模型,本模型以炎症、胶原纤维化所致的表现为主,靶器官累及皮肤和肺,并累及胃肠道、肝脏等其他器官,为进一步研究cGVHD发病机制及治疗cGVHD方面提供了良好动物模型。2.Bcl-6小分子抑制剂79-6下调外周血单个核细胞Bcl-6表达,抑制抗体分泌,减轻cGVHD小鼠临床评分及病理损伤,从而发挥抗cGVHD的作用。