【摘 要】
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γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid,GABA）是一种代谢性信号分子。在植物中,GABA参与的信号途径包括信号的产生、运输和效应细胞的响应机制尚未完全清晰。本论文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为研究对象,构建了谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）的GUS报告基因载体、启动子核定位荧光表达载体和基因全长荧光表达载体,从基因表达的
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γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid,GABA）是一种代谢性信号分子。在植物中,GABA参与的信号途径包括信号的产生、运输和效应细胞的响应机制尚未完全清晰。本论文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为研究对象,构建了谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）的GUS报告基因载体、启动子核定位荧光表达载体和基因全长荧光表达载体,从基因表达的组织水平、细胞的转录水平和翻译水平研究了GABA合成的关键基因GAD家族的5个成员基因的表达模式,并分析该基因家族的三重和四重突变体表型,为了解GABA合成的规律和基因表达的时空分布提供依据,得到如下结果:1.DNA序列分析表明,GAD基因家族的5个成员有不同数量的外显子和内含子,基因全长的序列的相似性为12.69%;启动子顺式作用元件分析表明,该基因家族富含CAAT-box、TATA-box和MYC结合的功能元件,表明具有相同的调控模式;在蛋白水平,基因编码的蛋白序列具有较高的保守性（63.36%）,具有3个相同的motif结构,表明该家族的酶活性受到相同的功能调节;蛋白功能的三维结构显示,GAD的5个成员具有相同的钙调蛋白（Ca M）结合序列。2.组织水平的GUS报告基因表达分析表明,pGAD1-GUS在幼苗的根、茎和叶脉有表达,在雌蕊中有表达;pGAD2-GUS在5天幼苗中表达量较低,但在10天幼苗中表达量增高,在根、茎和叶脉中均有表达,在植株的整个花序（花瓣、萼片、雌蕊和雄蕊）都有表达;pGAD3-GUS在幼苗组织的根和叶脉中表达,在成熟植株的雌蕊和雄蕊中均有表达;pGAD4-GUS在幼苗组织有表达,在雌蕊中有较强的表达;pGAD5-GUS在幼苗组织没有表达,在成熟植株里仅在花药里表达。3.在转录水平,启动子的荧光核表达分析,pGAD1-H2B-GFP主要在种子以及幼苗的茎端分生组织有较强荧光分布;pGAD2-H2B-GFP主要在雌蕊中有较强荧光表达,在茎端分生组织中心有荧光分布;pGAD3-H2B-GFP主要在种子中有强荧光,在花粉中也有荧光信号,在幼苗根端中柱鞘有强荧光信号;pGAD4-H2B-GFP主要在雌蕊柱头和角果部位有强荧光,在幼苗的茎端分生组织中心有强荧光信号;pGAD5-H2B-GFP在花粉中有强荧光。4.基因融合蛋白转基因植株分析结果表明,pGAD2-GAD2-GFP主要在雌蕊部位有较强荧光;pGAD3-GAD3-GFP在种子中有较强荧光,在花粉和茎端分生组织中心有弱荧光信号,在幼苗根尖中柱鞘有强荧光;pGAD4-GAD4-GFP主要在雌蕊柱头、角果以及幼苗的茎端分生组织中心中有强荧光;pGAD5-GAD5-GFP在花粉中有强荧光。5.在gad1 gad2 gad4 gad5突变体背景下,运用CRISPR/Cas9技术,构建了gad1 gad2 gad3 gad4 gad5五重突变体。突变体分析表明,碳饥饿和氮饥饿显著抑制了拟南芥野生型和突变体幼苗的生长,而突变体对营养胁迫更为敏感。总之,本研究运用GUS和GFP标记,全面分析了GABA合成的5个关键基因在拟南芥发育过程中的时空表达,表明了GAD家族的成员分布具有时间和组织分布的特异性,揭示了GABA信号的分布具有组织区域性和长距离运输的特性;突变体分析揭示了其对营养胁迫的敏感性。本研究为深入解析GABA在植物发育的信号途径提供了重要参考。
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