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micro RNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码内源性小RNA分子,能够在转录后水平参与真核生物的基因表达调控。miRNA作为高等真核生物体内的关键性因子,在抗病毒、肿瘤形成、凋亡代谢及分化发育等多种生物学进程中起到重要作用。成熟miRNA通常与mRNA(messenger RNA,mRNA)的3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)结合来抑制其翻译或降解mRNA。研究表明病毒编码的miRNA在病毒与宿主相互作用的过程中起到重要的作用。研究发现伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)在感染PK-15细胞后后,其长潜伏相关转录本(Large latency transcript,LLT)能够转录出包括prv-miR-LLT11a(登录号:MI0022083)在内11种成熟的miRNA,但是关于这些miRNA的表达时相及生物学功能研究的报道还很少见。因此,本研究选取PRV编码的prv-miR-LLT11a,对其表达时相、靶基因鉴定以及基因调控功能进行了初步研究,以期为PRV编码miRNA的功能研究奠定基础。1.茎环引物RT-qPCR检测PRV感染PK-15细胞后prv-miR-LLT11a的表达时相采用茎环引物实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测PRV感染PK-15细胞后prv-miR-LLT11a表达时相,为后续进一步研究其靶基因调控功能奠定基础。采用本实验室分离保存的PRV QBA野生株感染PK-15细胞,分别在第0、1、2、4、6、8、12和24 h收取细胞并提取小RNA,通过茎环引物RT-qPCR检测prv-miR-LLT11a不同时间点相对表达量。结果表明,PRV感染PK-15细胞后1 h,prv-miR-LLT11a的表达量就显著升高,2 h开始显著下降,至6 h表达量降至最低,从8 h开始再次显著升高,呈现出极其显著的差异性表达。结果预示,prv-miR-LLT11a在PRV感染过程中可能起到基因调控的作用。2.prv-miR-LLT11a靶向下调SLA-1基因的表达为研究prv-miR-LLT11a的靶基因调控功能,使用在线靶基因预测工具RNAhybrid对其靶基因进行预测,结果显示prv-miR-LLT11a能够体外靶向猪主要组织相容性复合体一类分子基因MHCⅠ(又称为猪白细胞抗原1,SLA-1)。为研究prv-miR-LLT11a与SLA-1的体外互作,扩增SLA-1的3’UTR,克隆到双荧光素酶报告基因载体pmir GLO中,构建真核表达载体SLA-1 3’UTR,同时构建含有SLA-1 3’UTR突变靶位点的载体SLA-1 3’UTR mut,利用双荧光素酶报告系统检测prv-miR-LLT11a与SLA-1的体外互作。结果显示,prv-miRLLT11a能够靶向猪SLA-1基因。将prv-miR-LLT11a模拟物(mimics)转染PK-15细胞,使用RT-qPCR和Western Blot分别检测过表达prv-miR-LLT11a对SLA-1在转录和翻译水平的表达影响。RT-qPCR结果显示,prv-miR-LLT11a能显著降低SLA-1的转录,在蛋白水平也有一定的抑制作用。为了进一步验证prv-miR-L-LT11a对SLA-1基因的调控作用,采用不同剂量prv-miR-LLT11a mimics转染,结果发现prv-miR-LLT11a对SLA-1基因的抑制作用在转录和翻译水平均没有剂量依赖性。prv-miR-LLT11a对SLA-1的表达调控是否影响机体抗原递呈的功能还需要进一步深入研究。3.prv-miR-LLT11a过表达对PLC表达及PRV增殖的影响多肽装载复合物(Peptide loading complex,PLC)是由抗原递呈相关转运体(Transporter associated with antigen processing,TAP)、Tapasin蛋白、钙联蛋白(Calnexin,CNX)、钙网蛋白(Calreticulin,CRT)、内质网蛋白(Endoplasmic reticulum protein,ERp)、β2m等分子组成,此复合物各组分与SLA-1协同作用,结合多肽将其转运到细胞表面,供CD8+T细胞识别,在机体发挥细胞免疫功能过程中起到重要作用。鉴于prv-miR-LLT11a对SLA-1的调控作用以及PLC与SLA-1在抗原转运过程中的协同作用关系,本研究旨在探讨prv-miRLLT11a过表达对PLC表达以及PRV增殖的影响。采用RT-qPCR和病毒蚀斑实验分别检测过表达prv-miR-LLT11a对PLC各组成基因表达及PRV增殖的影响。结果显示,prv-miRLLT11a过表达对TAP1基因的表达有显著的抑制作用,对PLC其余各组成基因的表达没有明显的影响作用,对PRV的增殖亦有明显的抑制作用。上述研究结果提示PRV可能通过编码miRNA调控抗原由胞质到内质网的转运通道以及自身基因表达来影响宿主的免疫应答过程。