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猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性、热性传染病。PR在多个国家和地区广泛流行,对养猪业危害极大,主要以仔猪致命性脑炎、育肥猪呼吸道症状及母猪流产为特征。20世纪末,随着PRV弱毒疫苗的使用以及部分规模化种猪场实施PR根除净化计划,该病在我国得到有效的控制。但自2011年10月以来,有超过20个省市免疫过PRV弱毒疫苗的猪场暴发了 PR。已有研究表明,PRV发生了一定程度的变异,传统的PRV弱毒疫苗已不能对流行的PRV变异株提供完全保护,这给我国PR的防控带来了巨大的挑战,也给养猪业造成了严重的经济损失。本研究通过对安徽地区不同发病猪场中疑似PR V感染的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定,并进一步对PRV分离株主要毒力基因(gE、gI、TK、gB、gC、gD基因)进行克隆、测序及其分子特征分析,以期了解该地区PRV的流行特征及遗传变异情况,为PR的防制提供科学依据。本研究利用PCR技术、细胞接种试验、病毒空斑纯化试验、透射电子显微镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒滴度测定(TCID50)、兔体接种试验等方法,对2016年1月～2018年12月安徽地区不同发病猪场中出现高热、呼吸道症状、神经症状、繁殖障碍、致命性脑炎等疑似PRV感染症状的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定;并根据GenBank中登录的PRV全基因序列设计6对特异性引物,进一步对PRV分离株gE、gI、TK、gB、gC、gD基因进行PCR扩增、目的片段的纯化、重组质粒的构建、酶切鉴定、序列测定及分子特征分析。结果显示,安徽地区253个发病猪场送检的550份病猪组织中共有15份病料经病原鉴定仅检测出PRV核酸阳性;处理后的病猪组织研磨液接种Vero细胞可见圆缩、聚集、合胞体、脱落等典型的细胞病变;分离病毒进行空斑纯化,细胞培养至1周左右通过结晶紫染色可见明显的直径在5 mm左右未染上色的近圆形空斑;透射电子显微镜下观察纯化浓缩后的病毒液可见球形、直径为180 nm左右,且与PRV大小结构相似的病毒粒子;在荧光显微镜下,病毒液感染Vero细胞后均能与PRV阳性血清抗体特异性结合产生明显的绿色荧光,显示15株分离病毒均为PRV;根据Reed-Mu ench法检测PRV的病毒滴度,传至第六代的15株PRV分离株TCID50介于10-3.12/0.1mL～10-6.459/0.1 mL之间;将106 TCID50剂量的病毒液接种成兔,兔子出现奇痒、局部被毛脱落、角弓反张等典型PR临床症状后死亡。试验设计6对引物均成功扩增出15株PRV分离株主要毒力基因序列,且扩增序列均与2011年后国内PRV变异株同源性较高,与欧美洲株均位于不同分支、亲缘关系较远;与2011年前国内PRV经典株序列比对,15株PRV分离株gl、TK基因序列并未发现明显的不同,而gE、gB、gC及gD基因序列存在多个位点的一致性替换、插入或缺失,且gE、gC基因碱基序列的部分突变位于其重要的抗原表位区。国内PRV流行变异株整体上并未表现出明显的区域特征,但15株PRV分离株主要毒力基因序列与湖北、河南、山东等邻近地区PRV变异株(如湖北HNX株、河南HN1201株、山东Qihe547株等)同源性均为100%。结果表明,本研究分离鉴定的15株PRV均为变异株,且15株PRV变异株之间的增殖及感染能力存在明显差异,变异株已成为安徽地区主要的流行毒株。15株PR V分离株的gI、TK基因序列较为保守,而gE、gC蛋白抗原表位区域氨基酸的突变可能导致其毒力及抗原性发生改变,进而影响传统疫苗的保护效果。安徽地区部分P RV分离株与邻近地区PRV序列同源性均为100%,可能与频繁跨省调运生猪、跨区引种等原因有关。