本实验室在新西兰青霉(Penicillium novae-zeelandiae)红色素研究领域有着良好的基础,在利用二元发酵及青霉纯培养生产红色素方面做了一系列探索,但研究多集中于发酵条件优化与产量的提高,对于红色素的产生机制及色素组分结构仍不清楚。从前人的研究中,发现P.novae-zeelandiae具有很强的红色素产生能力,因此本论文在研究如何提高青霉HSD07B纯培养产生红色素的基础上(包括最佳产红色素培养技术的建立和条件优化),进行了青霉HSD07B产红色素菌丝的转录组测序分析,以期能揭示红色素的产生机理,为工业发酵生产红色素提供理论支持和技术指导。经研究发现,青霉HSD07B在液体摇床发酵中并不产红色素,只有当将其静置培养形成菌膜后,才有红色素的产生。方法如下:以1 m L的接种量(孢子悬液浓度为2×107个/m L),接种于300 m L初始p H为6的PD培养基内,先于30℃、150 r/min恒温摇床内振荡培养40 h,之后静置于30℃培养箱内进行静置的界面菌膜培养。静置24 h便可形成产红色素菌膜,且初始产红色素速率很快,一直持续到发酵的第7 d,之后产红色素速率变得平缓,一般在第9 d发酵液中色素浓度达到最大。同时为了后续转录组测序的取样需求,本研究又建立了一种新的有支持物的界面菌膜培养法。对于有支持物的界面菌膜培养法,则是在上述培养方案的基础上,摇床振荡培养40 h后,将一片无菌滤膜悬浮置于发酵液表面,之后30℃静置培养,使发酵液内的菌丝以滤膜为附着物形成产红色素菌膜,使转录组测序的取样变得简便。取产红色素初期的红色菌丝T1,产红色素旺盛时期的红色菌丝T2,以及它们所对应时期的振荡培养的非产红色素菌丝Ck1与Ck2,通过Illumina平台进行无参考基因组的转录组测序,共得到16 G的测序数据,有21,204,700,934个reads,平均每个样本约有53亿个reads。对这些数据进行统计分析,得到unigenes 10621条。在这些基因中共有772个SNP位点和6475个SSR,得到有GO注释的unigenes共5496条,获得KEGG注释的unigenes有3086条,这将是后续基因表达差异分析的源数据。对测序数据进行分析,发现Ck1与T1之间有表达差异基因1148个,其中上调基因823个,下调基因325个。Ck2与T2之间有表达差异基因1789个,其中上调基因1257个,下调基因532个。通过差异基因的注释及分析,发现T1与Ck1的表达差异中有多个有关氧化还原功能的基因发生了变化,还有其有关膜方面的功能基因表达有所上调,这些基因都在形成菌膜初期被发现,可能是为了适应发酵方式的改变,与形成菌膜有关。在T2与Ck2的比对分析中,发现T2的红霉内酯合成酶活性、过渡金属离子结合功能、四吡咯结合功能、亚铁血红素结合功能、单加氧酶活性、铁离子结合功能等相关基因的表达有显著的上、下调,由于T2是处于产红色素的旺盛时期,所以这些基因很可能参与红色素的产生过程。并且,通过KEGG通路差异分析发现,在T1与Ck1和T2与Ck2的差异通路中,多环芳烃的降解通路都具有显著差异,这其中有诸多苯系物出现,可能与红色素的结构有关。