目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界范围内高发恶性肿瘤,居于世界恶性肿瘤发病率的第三位。因此探讨其发生机制,寻找有效的预防措施以及制定最佳的诊疗方案,将是降低其发病率和死亡率的关键。　　 业已发现,微卫星(Microsatellite,MS)的稳定情况与肿瘤发生关系密切。MS是简单DNA重复序列由1～6个核苷酸串联排列而成的,极易出现聚合酶复制错误。实验证实[1]肿瘤的发生可能存在微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI)和微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)不同途径。MSI是指由于DNA复制错误引起简单重复序列的增多或减少,它可以使整个基因组稳定性下降,随机突变率增高,导致一系列肿瘤相关靶基因的改变,引起肿瘤发生。而MSI的发生又与错配修复基因(mismatchrepair gene,MMR)关系密切,MMR基因表型改变,尤其是两个关键基因hMLH1(human mut-l homologue1,hMLH1)和hMSH2(human mut-shomologue2,hMSH2)的改变可能会导致基因组不稳定而产生MSI,进而促进肿瘤的发生、发展。　　 MMR是DNA修复系统中的重要工具酶,其功能主要为修复错误配对的碱基。MMR超家族有9种错配修复酶,其中以hMSH2和hMLH1功能最重要,二者在很多肿瘤中表达缺失或降低。本实验通过选择hMSH2表达缺失的Lovo细胞株,进而观察药物作用对hMLH1基因和蛋白表达的影响及相关因素分析。有研究发现,DNA局部高甲基化可以引起染色体结构改变,并且促进杂合缺失或等位基因缺失[2]。而MSI结直肠癌中hMLH1蛋白的表达缺失与hMLH1基因启动子CpG岛甲基化有关。研究表明[2],hMLH1启动子CpG岛甲基化引起的蛋白表达缺陷是引起散发性胃肠肿瘤MSI的主要原因。　　 非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-nflammatory drugs,NSAIDs)是临床上常用的解热镇痛抗炎药,研究发现NSAIDs对结直肠癌具有预防和治疗作用[3]。其机制主要是通过抑制COX-2发挥抗肿瘤作用,还可以通过激活细胞信号转导通路中P38MAPK来诱导肿瘤细胞的凋亡,但对于COX-2低表达的MSI肿瘤,阿斯匹林和舒林酸[4]作用于错配修复酶缺陷的结肠癌细胞株,可显著减少其MSI表型,预防大肠息肉向癌转化,甚至可以逆转早期大肠癌,因此通过影响MMR蛋白表达也是NSAIDs抗肿瘤的另一途径,其机制尚不十分明确。　　 本研究应用非选择性环氧化酶抑制剂吲哚美辛(Indometacin)作用于MSI阳性(hMSH2表达缺失)的人结肠癌lovo细胞株,通过蛋白印迹(Western-blot)、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation Specific PCR,MSP)等方法,观察药物对lovo细胞增殖、hMLH1、微卫星不稳定性及DNA错配修复基因CpG岛甲基化的影响,初步探讨NSAIDs预防和治疗机制,寻找更有效的分子标志,以期为结直肠癌的发生、治疗及预防提供实验基础和理论依据。　　 方法:　　 1材料:人结肠癌lovo细胞株:MSI阳性(hMSH2表达缺失);非选择性环氧化酶抑制剂Indometacin。　　 2方法:　　 2.1用甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组lovo细胞株的增殖情况,以确定半数抑制浓度(IC50):设立空白对照组(control)、溶剂对照组(solvent)、药物组;药物浓度为12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L200μmol/L。作用时间:72h,测定IOD值,计算细胞生长抑制率,根据公式确定IC50。　　 2.2实验分组:　　 2.2.1浓度分组:根据IC50分别选取三个不同浓度,Indometacin:25gmol/L、50μmol/L、100μmol/L作用于lovo细胞株。　　 2.2.2时间分组:选取药物IC50以下三个浓度作用于lovo细胞株,24h、48h、72h收集细胞。　　 2.3检测指标:　　 2.3.1应用蛋白免疫印迹(Western-blot)的方法检测药物作用不同时间各组细胞hMLH1、hMSH2蛋白的表达情况。　　 2.3.2采用聚合酶链反应(PCR)技术对各组细胞基因组DNA的5个微卫星位点(BAT-25,BAT-26,D2S123,D5S346,D17S250)进行扩增,检测MSI情况。　　 2.3.3采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation Specific PCR,MSP)技术对各组细胞基因组DNA中hMLH1和hMSH2启动子CpG岛进行扩增,　　 检测二种基因启动子甲基化状态及变化。　　 结果:　　 1 Indometacin对lovo细胞株增殖的影响　　 Indometacin作用于lovo细胞72h,IC50为104.23μmol/L。Indometacin可抑制lovo细胞增殖,并且随着药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强。溶剂对细胞生长未见明显影响。　　 2 Western-blot检测对lovo细胞hMLHI和hMSH2蛋白的影响　　 hMLH1、hMSH2蛋白分子量分别为85kD、110kD,Western杂交后于相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析,蛋白含量以IOD表示,以β-actin蛋白做为内参,以相对积分光密度比较蛋白表达高低。Indometacin对hMLH1蛋白表达影响随药物作用时间延长其作用逐渐增强,在作用于lovo细胞72h后,hMLH1蛋白表达量增高明显(P＜0.05)。Lovo细胞hMSH2在药物作用前后均未见表达。　　 3微卫星不稳定检测结果　　 (1)BAT-25检测结果　　 BAT-25DNA终产物大小为～90bp,PCR产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后于相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析,DNA含量以IOD表示,以18s为内参,以相对积分光密度比较基因DNA表达高低。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-25DNA产物IOD值分别为(0.70±0.01)、(0.63±0.02)和(0.52±0.01),明显低于对照组(0.98±0.01)(p＜0.05)。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-25DNA产物IOD值分别为(0.60±0.03)、(0.52±0.01)和(0.37±0.01),明显低于对照组(0.98±0.01)(p＜0.05)。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-25DNA产物IOD值分别为(0.47±0.02)、(0.38±0.02)和(0.23±0.02),明显低于对照组(0.98±0.01)(p＜0.01)。其各浓度组之间差异亦有统计学意义(p＜0.05)。随着药物浓度的增加,BAT-25表达逐渐减少,尤以48h减少最为明显。　　 (2)BAT-26检测结果　　 BAT-26DNA终产物大小为80～100bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-26DNA产物IOD值分别为(1.20±0.03)、(1.00±0.02)和(0.77±0.03),明显低于对照组(1.33±0.02)(p＜0.05)。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-26DNA产物IOD值分别为(1.08±0.03)、(0.92±0.02)和(0.75±0.03),明显低于对照组(1.33±0.02)(p＜0.05),其中72h有显著差异(p＜0.01)。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-26DNA产物IOD值分别为(0.97±0.02)、(0.75±0.02)和(0.29±0.03),明显低于对照组(1.33±0.02)(p＜0.05)。其各浓度组之间差异亦有统计学意义(p＜0.05)。随着药物浓度的增加,BAT-26表达逐渐减少,尤以24h减少趋势最明显。　　 (3)D2S123检测结果　　 D2S123DNA终产物大小为197～227bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D2S123DNA产物IOD值分别为(0.79±0.03)、(0.65±0.03)和(0.46±0.02),明显低于对照组(1.12±0.01)(p＜0.05)。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D2S123DNA产物IOD值分别为(0.69±0.02)、(0.41±0.02)和(0.30±0.02),明显低于对照组(1.12±0.01)(p＜0.05)。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D2S123DNA产物IOD值分别为(0.62±0.01)、(0.35±0.02)和(0.19±0.01),明显低于对照组(1.12±0.01)(p＜0.05)。其各浓度组之间差异亦有统计学意义(p＜0.05)。随着药物浓度的增加,D2S123表达逐渐减少,尤以48h减少趋势最明显。　　 (4)D5S346检测结果　　 D5S346DNA终产物大小为96～122bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D5S346DNA产物IOD值分别为(0.95±0.01)、(0.87±0.02)和(0.73±0.01),明显低于对照组(1.05±0.01)(p＜0.05)。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D5S346DNA产物IOD值分别为(0.85±0.02)、(0.71±0.02)和(0.63±0.01),明显低于对照组(1.05±0.01)(p＜0.05)。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D5S346DNA产物IOD值分别为(0.79±0.02)、(0.67±0.01)和(0.46±0.01),明显低于对照组(1.05±0.01)(p＜0.05)。其各浓度组之间差异亦有统计学意义(p＜0.05)。随着药物浓度的增加,D5S346表达逐渐减少,尤以48h减少最为明显。　　 (5)D17S250检测结果　　 D17S250DNA终产物大小为～150bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D17S250DNA产物IOD值分别为(0.93±0.02)、(0.71±0.03)和(0.44±0.03),明显低于对照组(1.07±0.02)(p＜0.05)。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D17S250DNA产物10D值分别为(0.76±0.02)、(0.68±0.02)和(0.31±0.02),明显低于对照组(1.07±0.02)(p＜0.05)。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D17S250DNA产物10D值分别为(0.72±0.01)、(0.54±0.02)和(0.27±0.03),明显低于对照组(1.07±0.02)(p＜0.05)。其各浓度组之间差异亦有统计学意义(p＜0.05)。随着药物浓度的增加,D17S250表达逐渐减少,尤以24h减少趋势最明显。　　 4 hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化检测结果　　 hMLH1,hMSH2基因启动子CpG岛甲基化DNA终产物分别为115bp、132bp,CpG岛非甲基化DNA终产物分别为124bp、137bp,MSP产物行琼脂糖凝胶电泳后于相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析,DNA含量以IOD表示,以18s为内参,以相对积分光密度比较基因DNA表达高低。　　 Indometacin作用前后,hMLH1基因启动子CpG岛均有甲基化DNA产物,非甲基化DNA产物阴性;hMSH2基因启动子CpG岛均为非甲基化DNA产物,甲基化DNA产物阴性。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,hMLHl基因启动子CpG岛甲基化DNA产物IOD值分别为(0.88±0.03)、(0.78±0.03)和(0.69±0.02),明显低于对照组(0.94±0.01)(p＜0.05)。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化DNA产物10D值分别为(0.69±0.03)、(0.66±0.03)和(0.60±0.02),明显低于对照组(0.99±0.01)(p＜0.05)。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化DNA产物IOD值分别为(0.51±0.02)、(0.46±0.03)和(0.38±0.02),明显低于对照组(0.96±0.02)(p＜0.01)。其各浓度组之间差异亦有统计学意义(p＜0.05)。随着药物浓度的增加,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化频率逐渐降低,尤以24h降低最为明显。　　 结论:　　 1 Indomethacin对人结肠癌lovo细胞株生长的抑制作用呈时间和剂量依赖性。　　 2 Indomethacin可以促进lovo细胞株hMLH1蛋白表达。　　 3随着Indomethacin作用时间及浓度的增加hMLH1 CpG岛甲基化水平明显降低,MSI五个位点BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250表型减少。Indomethacin可通过hMLH1基因启动子CpG岛去甲基化,恢复hMLH1功能,减少MSI发生。　　 4 lovo细胞株hMSH2蛋白表达缺失与其基因启动子CpG岛甲基化无关。