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作为细胞的“能量工厂”,线粒体是高毒性环境污染物苯硫酚优先进攻的靶标,同时与痕量苯硫酚残留引起的致病活性氧(ROS)的产生有关。为了实时、准确的监测这些过程,本文开发一种能高灵敏检测线粒体内苯硫酚的荧光探针。检测衰老细胞有助于阐明衰老相关过程以及诊断衰老相关疾病等。衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作为一种溶酶体水解酶,是目前应用最广泛的细胞衰老生物标志物。但是,在生物体中检测SA-β-gal时,非衰老相关β-gal通常会产生一定的干扰。考虑到SA-β-gal与其它非衰老相关β-gal所处的溶酶体pH有可能不同,本文开发一种能识别溶酶体pH的β-gal荧光探针。具体内容如下:(1)本文开发了一种新型半罗丹明半荧光素(rhodol)染料ROAP,并以此为荧光团、2,4-二硝基苯基为识别基团、吡啶盐为线粒体定位基团,构建了线粒体靶向的苯硫酚荧光探针ROAL。该探针对苯硫酚有高的选择性和灵敏度,且检出限低至8.1 nM。共定位实验表明探针ROAL具有良好的定位线粒体的能力,其皮尔森相关系数高达0.95,从而实现了特异性检测线粒体内苯硫酚。此外,本文还将探针ROAL应用于苯硫酚刺激的固定细胞和活细胞中进行成像研究,结果发现固定细胞显示出强荧光,而活细胞显示出弱荧光,说明苯硫酚会诱导活细胞的线粒体产生活性氧,并且产生的活性氧又能消除苯硫酚。(2)本文以pH敏感的半花菁染料CPH为骨架,β-半乳糖苷键为识别位点,构建了一种可识别溶酶体pH的β-gal荧光探针CA。由于溶酶体的pH范围为4.0-6.0,米曲霉β-半乳糖苷酶(A.oryzaeβ-gal)的活性最适pH为4.0-5.0,大肠杆菌β-半乳糖苷酶(E.coilβ-gal)的活性最适pH为7.4,所以在体外实验中,本文选择A.oryzaeβ-gal和E.coilβ-gal共同验证探针CA的pH敏感性。探针CA与A.oryzaeβ-gal反应显示出绿色荧光,与E.coilβ-gal反应显示出红色荧光,结果表明CA在不同pH下均能检测β-gal,并且呈现出不同的荧光信号,证明探针CA的确可同时检测溶酶体pH和β-gal。本文还将探针CA应用在卵巢癌细胞SKOV-3和不同衰老程度的人胚肺成纤维细胞MRC-5中成像β-gal,实验结果表明探针CA不仅能区分成像SA-β-gal和SKOV-3β-gal,而且也成功监测了细胞的衰老过程。