研究目的1．利用腺病毒表达载体将肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），用流式细胞术检测基因转染效率，原位杂交及免疫组化检测转染后外源基因HGF的表达。2．建立激素性早期兔股骨头缺血坏死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）模型，用CT灌注成像（CT perfusion imaging，CTP）及MRI动态增强（dynamic contrast-enhanced MR imaging，DCE-MRI）进行影像学观察，探讨ANFH影像学灌注异常与股骨头血流动力学改变及病理改变的关系。3．经皮股骨头穿刺，向兔缺血坏死股骨头内移植转染HGF基因的BMSCs，行CTP、DCE-MRI及病理检查，探讨Ad-HGF转染BMSCs对改善股骨头血供、促进坏死修复、骨质重建的作用，以及影像学对基因治疗ANFH的监测作用。材料与方法1 Ad-HGF转染骨髓间充质干细胞的制备及体外实验1．1腺病毒载体Ad-HGF、Ad-GFP的构建携带HGF基因和报告基因．绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的重组腺病毒（adenovirus）载体Ad-HGF、Ad-GFP，均委托本元正阳基因技术有限公司构建。1．2兔BMSCs的分离培养抽取4周龄纯新西兰大白兔骨髓15ml，离心去除表面上清及脂肪细胞，加10％胎牛血清DMEM培养液置于培养箱中接种培养，更换培养液时弃掉悬浮细胞，待贴壁细胞长至接近融合时（2周），胰酶消化，传代培养至第二代细胞时备用。1．3 Ad-GFP转染BMSCs转染效率及表达持续时间的检测第二代BMSCs经胰酶消化，以1.5×10⁵／孔的密度接种于6孔板中，培养箱培养，每孔加50μl含11个不同MOI值（multiple of infection，感染复数）的Ad-GFP病毒液进行BMSCs转染，对每个MOI设置3个复孔。48h后胰酶消化收集细胞、PBS洗涤后流式细胞术检测表达GFP的阳性细胞率。Ad-GFP以MOI=300转染BMSCs，于转染后不同时间，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，流式细胞术分别检测转染不同时间BMSCs表达GFP的阳性细胞率。1．4原位杂交及免疫组化检测HGF在BMSCs中的表达以MOI=300的Ad-HGF转染BMSCs，胰酶消化并收集细胞；将转染后的BMSCs滴加于硅化玻片上，制备细胞爬片，进行原位杂交及免疫组化检测。2兔股骨头缺血坏死模型的建立及影像学观察2．1激素诱导股骨头缺血坏死实验动物模型的制备选用26只健康成年纯新西兰大白兔，平均体重（2.53±0.11）kg。随机分为模型组20只，正常对照组6只。模型组经兔耳缘静脉缓慢推注10ml／kg马血清，间隔二周后，按5ml／kg连续2天以相同方法注射马血清；2周后，腹腔注射7.5mg／kg醋酸泼尼松龙，每周二次，共4次。模型组动物随机分3组，3周组4只、4周组8只、5周组8只分别于注射激素第3、4、5周末进行影像学检查，于动物注射激素第5周末处死对照组及4只模型兔，作墨汁灌注及病理。2．2 CT检查方法及数据采集采用Lightspeed 16螺旋CT扫描机。先行髋关节常规横断面扫描，然后定位选择包括双侧股骨头在内的lcm范围内的层面，采用轴扫模式，层厚2.5mm×4，1秒1次，间隔1s，耳缘静脉以1.5ml／s推注4ml对比剂，进行同层动态增强扫描，共扫描45次（90秒）。应用AW4．2工作站自带软件perfusion 3中的骨模式算法对灌注图像进行后处理，以股骨头旁动脉作为输入动脉，分别于股骨头、股骨干骨髓腔及臀肌选取感兴趣区（region of interest，ROI）。软件自动测出各ROI各扫描点的CT值，并自动绘制相应的时间-密度曲线（time density curve，TDC），以及各灌注参数图及数值，包括血流量（blood flow，BF）、血容量（blood volume，BV）、平均通过时间（mean transit time，MTT）及毛细血管表面通透性（permeability surface area product，PS）；计算峰值强化幅度（enhancement amplitude，EnA）、峰值强化率（percentage of enhancement，En％）。每一数值均取三次测量值的平均值。2．3 MRI检查方法及数据采集采用Magnetom Vision PLUS 1.5T超导型MRI机，头部正交线圈，选用快速自旋回波序列T₂WI TR／TE 4500ms／96ms，TIWI TR／TE 550ms／20ms，以及FS-T₂WI，冠状位，层厚3mm，层间隔0.3mm；同层动态增强扫描采用快速梯度回波序列，TR／TE 80ms／15～60ms，30°翻转角，脂肪抑制，扫描时间11s／次，共20次（220s）。Gd-DTPA注射剂量为2ml，注射速度为1ml／s。应用MRI主机软件，分别选择股骨头、股骨干骨髓腔及臀肌作为ROI，自动算出各ROI在各扫描点的信号强度（signal intensity，SI），并自动生成信号强度-时间曲线（signal intensity-time curve，SI-T曲线）；计算各ROI各扫描点强化率En％，并绘制时间-En％曲线，计算该曲线的最大强化率En％max及强化斜率EnR。3 Ad-HGF转染BMSCs治疗兔股骨头缺血坏死的初步研究及影像学观察3．1动物分组14只（4只病理，2只意外死亡）激素诱导股骨头缺血坏死模型兔中，剔除CT灌注参数及／或MRI动态增强曲线与平均值差异较大的3只，剩下11只模型兔随机分为3组：自然修复组3只（6个股骨头）；基因治疗组8只兔右侧8个股骨头；单纯穿刺组8只兔左侧8个股骨头。3．2治疗方法与观察时间基因治疗组：CT引导下经皮穿刺股骨头，向兔右侧股骨头注入转染HGF的BMSCs（1-2×10⁶）个，约相当于0.2ml。单纯穿刺组：按上述方法穿刺股骨头，不注射BMSCs。自然修复组：空白对照，不作任何处理。治疗后2及4周进行影像学检查，4周末处死动物作病理及墨汁灌注。4墨汁灌注及病理动物麻醉，手术暴露并穿刺腹主动脉，生理盐水加压灌洗，将墨水与右旋糖酐以7：3的比例混合，注入血管约100ml，至双下肢皮肤、甲床变为黑色。取材、固定、脱钙、切片，立体显微镜观察股骨头血管分布。实验兔处死后，剖取双侧股骨头连同干骺端，固定、脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察骨小梁、造血组织的变化。5统计学分析采用SPSS 13．0软件包进行统计学分析。所有数据均以（均值±标准差）表示，体外实验中表达GFP的阳性细胞率、正常与模型组间CTP各灌注参数及DCE-MRI最大强化率及最大强化斜率的比较，采用完全随机设计资料的方差分析方法（one-wayANOVA），P＜0.05，被认为有显著性差异。基因治疗组、单纯穿刺组及自然修复组之间以及不同治疗时间CTP灌注参数及DCE-MRI峰值强化率及强化斜率的比较，采用完全随机设计资料重复测量数据的方差分析方法（repeated measures），P＜0.05，被认为有显著性差异。结果1 Ad-HGF转染骨髓间充质干细胞的制备及体外实验1．1 Ad-GFP转染BMSCs转染效率及表达持续时间的检测Ad-GFP以不同的MOI转染兔BMSCs 48h后，表达GFP的阳性细胞率有显著性差异（P＜0.05），随着MOI的增加，表达GFP的阳性细胞率逐渐增加，但当MOI大于200以上，表达GFP的阳性细胞率无显著性差异（P＞0.05）；MOI=300时表达GFP的阳性细胞率达98％以上，因此选择MOI=300转染BMSCs。Ad-GFP以MOI=300转染兔BMSCs后不同时间，表达GFP的阳性细胞率有显著性差异（P＜0.05）。转染后24h即可见GFP表达，2至7天时表达最高，7天后显著下降，28天时仍可检测到GFP的表达。1．2原位杂交及免疫组化检测HGF在兔BMSCs中的表达将Ad-HGF以MOI=300转染兔BMSCs后，原位杂交及免疫组化检测结果显示：细胞的胞核和胞浆中有棕黄色颗粒性阳性杂交信号，胞浆内有丰富的HGF蛋白表达，表明Ad-HGF可高效转染BMSCs，并BMSCs有HGF mRNA及蛋白的高表达。2兔股骨头缺血坏死模型的建立及影像学观察2．1 CT2．1．1常规CT模型组兔股骨头表现较轻，仅可见股骨头皮质模糊，皮质下松质骨内小点状低密度影，骺线模糊不清，干骺端密度增高。2．1．2 CTPTDC曲线模型3周组兔股骨头TDC形态与正常对照组相似：模型4周组TDC上升段缓慢并幅度减小，波峰更平滑持续时间更长；模型5周组TDC呈低平型。2．1．3 CTP灌注参数比较正常组及模型各组股骨头BF、BV、PS值均有显著性差异（P＜0.05）。正常兔股骨头BF、BV值分别为（70.53±9.31）ml／（min·100g）、（10.28±2.05）ml／100g。给予激素后3周股骨头BF、BV值变化不明显，4周末BF、BV值开始下降，分别为（30.65±4.64）ml／（min·100）、（5.83±1.60）ml／100g；5周末BF、BV下降更明显，分别为（16.40±6.17）ml／（min·100g）、（3.37±1.57）ml／100g，分别下降了76.75％、67.22％；正常组及模型各组股骨头TDC EnA、En％亦呈现类似改变。正常时股骨头峰值强化平均增加（39.76±8.92）Hu，强化率为（4.96±1.25）％，4周末下降至（20.99±6.76）Hu、（2.78±1.28）％，5周末下降至（9.51±3.24）Hu、（1.19±0.38）％。2．2 MRI2．2．1常规MRI模型兔股骨头表现为关节积液增多；皮质下骨髓中可见小点状或条状T₂WI高信号影，以FS-T₂WI显示最清楚；干骺端T₂WI高信号；股骨干骨髓水肿，T₂WI及FS-T₂WI高信号。2．2．2 DCE-MRI SI-T曲线模型3周组股骨头SI-T曲线形状及上升幅度均与正常组接近（约200左右）；模型4周组股骨头SI-T曲线形状同前，但上升幅度开始降低（约100左右）；模型5周组股骨头SI-T曲线上升幅度明显降低，仅上升约50左右。2．2．3时间-En％曲线及峰值强化情况正常组与模型3周组股骨头时间-En％曲线接近，模型4周组曲线下降，模型5周组曲线下降更明显，曲线最低。正常组及模型各组股骨头En％max及EnR有显著性差异。正常兔股骨头En％max及EnR分别为（70.58±13.62）％、（55.00±10.62）％／min；注射激素3周时股骨头En％max与正常组股骨头En％max无显著性差异，仅表现为峰值强化时间推迟；4周开始股骨头En％max、EnR有明显下降，分别为（50.22±11.21）％、（27.39±6.11）％／min，5周末下降更明显，分别为（17.03±9.02）％、（13.27±7.03）％／min。2．3墨汁灌注及病理正常股骨头HE染色：骨膜光滑，软骨细胞排列整齐；骨小梁完整规则，空骨陷窝少见；骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少。墨汁灌注骨髓腔内毛细血管丰富，形成血管网，血管结构清晰。模型组股骨头HE染色：软骨部分脱落，骨小梁稀疏变细，空骨陷窝增多；骨髓腔内造血组织明显减少，细胞数目及网状结构较正常稀疏，脂肪细胞体积增大，部分融合成泡状。墨汁灌注显示股骨头血管显著减少，骨髓腔内毛细血管稀疏，灌注不全面。3 Ad-HGF转染BMSCs治疗兔股骨头缺血坏死的初步研究及影像学观察3．1 CT基因治疗组2周时CTPTDC形态有不同程度的上升，表现为类似正常股骨头TDC形态，但上升的幅度较正常略低，约25-30Hu左右；4周时股骨头TDC形态基本与2周时相似，但上升幅度下降，约20Hu左右。单纯穿刺组2周时股骨头CTP TDC形态亦表现类似基因治疗组，但上升幅度较低，4周时曲线上升幅度下降，呈现低平型。自然修复组CTPTDC曲线形态呈低平型。不同处理方法股骨头灌注参数BF及EnA有显著性差异（P＜0.05），无论是2周还是4周，Ad-HGF转染BMSCs治疗组股骨头BF值及EnA最高，其次是单纯穿刺方法，自然修复组最低。2周时，自然修复组股骨头BF及EnA分别为（10.40±3.84）ml／min·100g、（9.72±1.89）Hu；基因治疗组股骨头BF为（45.42±9.43）ml／min·100g，增加了3.37倍，恢复到正常组股骨头BF的64.40％，EnA为（28.14±1.48）Hu，增加了1.9倍，恢复到正常组股骨头EnA的70.77％。Ad-HGF转染基因治疗组及单纯穿刺组灌注参数在不同时间亦有显著性差异（P＜0.05），2周时BF、BV及EnA较4周时高。4周时单纯穿刺组与自然修复组股骨头灌注参数BV及En％均无显著性差异，而基因治疗组与自然修复组BF、BV及EnA、En％均有显著性差异。不同处理方法股骨头灌注参数PS有显著性差异，主要是基因治疗组与自然修复组之间有显著性差异。3．2 MRI治疗2周时，基因治疗组与单纯穿刺组股骨头SI-T曲线均有不同程度的上升，但基因治疗组较单纯穿刺组上升幅度明显；4周时，基因治疗组股骨头SI-T曲线仍有上升，单纯穿刺组股骨头SI-T曲线上升不明显。不同处理方法股骨头En％max及EnR有显著性差异（P＜0.05），Ad-HGF转染BMSCs治疗组股骨头En％max和EnR最高，其次是单纯穿刺治疗方法，自然修复最低。Ad-HGF转染BMSCs治疗组在不同时间股骨头En％max和EnR亦有显著性差异（P＜0.05），2周时En％max及EnR较4周时高。4周时单纯穿刺组与自然修复组股骨头En％max无显著性差异，而基因治疗组与自然修复组En％max及EnR均有显著性差异。3．3墨汁灌注及病理基因治疗组HE染色见小血管数目增多，造血细胞增多，骨小梁成骨活跃，新骨形成，并可见组织的重建和修复现象；墨汁灌注显示软骨下骨小梁内的骨髓中血管网增多，小血管较丰富。单纯穿刺组HE染色见血管稍增多，组织修复较轻，可见纤维组织增生包绕死骨；墨汁灌注显示股骨头血管轻度增多，灌注不全面，部分墨汁外渗。自然修复组：HE染色见股骨头坏死较模型组更重，并出现血管内血栓形成。墨汁灌注显示股骨头血管显著减少，基本未见灌注。结论1．Ad-GFP可成功转染骨髓间充质干细胞，Ad-GFP以MOI=300转染BMSCs，转染率可达98％以上，24 h即可见绿色荧光，2-7天转染率最高，28天仍可见转染。表明重组腺病毒作为载体转染骨髓间充质干细胞具有高转染率与稳定表达。2．骨髓间充质干细胞作为靶细胞，来源充足、取材较容易、体外分离培养纯化可大量扩增，操作性强。3．原位杂交及免疫组化检测结果表明，Ad-HGF可高效转染BMSCs，并有HGF mRNA及蛋白的高表达。4．马血清加激素诱导早期兔股骨头缺血坏死的成模率及动物存活率较高，病理改变主要为空骨陷窝增多，骨髓内造血细胞减少，脂肪细胞大量聚集，体积增大，压迫髓内血管床造成股骨头缺血，与ANFH的影像学表现密切相关。5．CT灌注成像及MRI动态增强扫描均能较好反映股骨头血流动力学改变，可定量观察ANFH股骨头微循环的改变。缺血的股骨头血流灌注降低，表现为CTP灌注参数BF、BV及PS降低，TDC峰值强化下降；DCE-MRI时间-强化率曲线下降，En％max及EnR降低，并随着时间的延长呈逐渐下降趋势。6．CT灌注成像及MRI动态增强扫描均能较好反映ANFH股骨头血流动力学改变，可定量监测ANFH基因治疗后股骨头微循环的改变。Ad-HGF转染BMSCs可增加股骨头血流灌注，表现为股骨头CTP灌注参数BF、BV及PS值升高、TDC峰值强化增加；DCE-MRI时间-强化率曲线上升，En％max及EnR增加。7．Ad-HGF转染的BMSCs植入ANFH股骨头后，病理证实股骨头血管数目增多，骨小梁成骨活跃，新骨形成，并可见组织重建和修复现象。表明Ad-HGF转染的BMSCs能够促进缺血的股骨头血管再生，进而促进骨再生，加速坏死骨的修复；提示其在治疗ANFH方面具有良好的应用前景。