研究背景冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。冠脉狭窄引起心肌缺血甚至心肌梗死(心梗)与病死率密切相关,缺血时间越长,心梗面积越大,患者预后越差。尽快恢复心肌灌注,挽救濒死心肌,防止梗死扩大是急性心梗的基本治疗原则。然而,再灌注会引起再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/R损伤)。I/R损伤的机制包括氧自由基生成增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞活化和损伤以及自噬等。其中自噬是目前研究的热点,被认为在心肌缺血-再灌注损伤中发挥着非常重要的作用。自噬是溶酶体介导的对长命蛋白质和损伤细胞器进行回收的过程,对线粒体等细胞器的降解和周转起关键作用。在I/R时,细胞内ATP减少以及AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)活性增高均可激活自噬信号通路。另外,唯BH3域蛋白的表达上调、细胞内钙离子浓度增加、活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)、过量的一氧化氮、线粒体通透性转运孔的开放、内质网应激和非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)等均可促进心肌细胞的自噬。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路、Ras/cAMP依赖的蛋白激酶A通路、胰岛素/生长因子信号通路以及LKB1-AMPK通路调节着自噬活性。在真核细胞中,雷帕霉素可抑制mTOR而激活自噬,而3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素等可通过抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)而抑制自噬。线粒体是心肌细胞总含量最丰富的细胞器,其对于维持细胞功能非常重要。心肌细胞I/R会导致线粒体功能障碍,主要表现为线粒体膜电位除极化以及线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开放。线粒体功能障碍可以使心肌[ATP减少,氧自由基生成以及促凋亡蛋白释放,造成细胞死亡。氧自由基又可以进一步加重线粒体损伤,形成恶性循环。线粒体膜电位除极化、线粒体通透性转换孔开放以及氧自由基均可激活自噬,后者清除损伤的线粒体,从而挽救濒死的心肌细胞。然而,当自噬过度激活时,自噬可过度清除细胞内的细胞器,从而引起细胞自噬性死亡大量文献报道在心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygen, A/R)以及心肌I/R时,自噬活性上调。但在A/R或I/R的时程与自噬活性的关系上存在争议。有研究认为缺血或缺氧时间过短不改变自噬活性,也有报告显示缺血抑制而再灌注上调自噬活性,甚至有研究提出缺血期的自噬增枪保护心肌,而再灌注期的自噬增强则损害心肌。多数研究报告啮齿类动物缺血超过30min和/或再灌注时间超过2h均可促进心肌细胞的自噬。不少研究认为自噬的增强对缺血心肌有保护作用,但同样也有不少研究认为自噬加重心肌损伤。关于自噬在I/R的作用之所以会产生如此大的分歧,可能与实验设计和研究于段的局限性有关。文献报道的相关研究,多是对单一I/R状态下的集中研究,而没有对不同I/R状态下自噬功能作用进行比较性研究。比如,轻度和重度I/R损伤时,自噬增强所产生的作用未必是一样的。我们设想,过低或过高的自噬可能都是有害的,那么用基因敲除和过表达的研究手段得出的结果应该谨慎解释。如果能确定心肌I/R损伤时自噬的“安全范围”,则有望操控自噬活性来达到治疗目的。研究目的在新生大鼠心肌细胞培养的A/R模型和小鼠心肌I/R模型中,观察不同的缺氧时间和缺血时间对自噬活性的影响,并用自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂渥曼青霉素调节自噬,来研究自噬在心肌细胞A/R及心肌I/R中的作用及其机制,借此阐明自噬在I/R损伤中的作用机制,为心肌的I/R损伤提供有效的治疗靶点。方法1.离体研究分离1-2日龄SD乳鼠中心肌细胞,按常规进行原代培养,做下列检测：(1)4,5-二甲基-2-噻唑基(2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)法检测细胞生存率,设对照组、雷帕霉素组和渥曼青霉素组,置于缺氧孵箱中分别缺氧0h、6h、和24h,然后复氧4h, MTT比色,于分光光度仪下测吸光度值,比较各组细胞生存率变化。(2)凋亡检测将心肌细胞接种于激光共聚焦小血,设对照组、雷帕霉素(200nM)和渥曼青霉素(200nM)组,药物预处理30min后,置于缺氧孵箱中分别缺氧0h、6h和24h,复氧4h。用Hoechst33258染核,检测心肌细胞凋亡率。(3)检测自噬将细胞接种于6孔板或激光共聚焦小皿,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine, MDC)染色后用激光共聚焦检测其荧光信号,定量分析自噬活性；或将细胞用胰酶消化、离心后用戊二醛固定,电镜检测其中自噬体形成；或提取细胞总蛋白,用免疫印迹(western blot)分别检测LC3-Ⅱ和Beclinl的表达水平。(4)检测mPTP开放,将钙黄绿素和氯化估与心肌细胞共孵育30min后,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗3次,胰酶消化后,用等体积含10%胎生血清DMEM/F12终止消化,流式细胞仪检测其荧光强度。激光共聚焦检测mPTP：将钙黄绿素和氯化钴与心肌细胞共孵育30min后,PBS漂洗3次,激光共聚焦检测。(5)线粒体膜电位除极化检测：将JC-1探针与心肌细胞共孵育30min后,PBS漂洗3次,激光共聚焦检测线粒体膜电位除极化水平。2.在体研究在动物水平上,将8-10周龄C57BL/6J小鼠分为对照组、雷帕霉素组和渥曼青霉素组,腹腔注射药物30min后,麻醉,人工呼吸,左侧第4肋间开胸,暴露心脏,结扎左冠状动脉,分别缺血40min后松开结扎,恢复冠脉灌注。假手术组只开胸不结扎。观察指标：酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测血清乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、2,3,5—氯化三苯基四氮唑(tetracycline, TTC)法测定心梗面积、超声检查左室内径和收缩功能、免疫印迹及电镜检查自噬水平。计量数据以均数±标准误(mean±SE)表示,统计分析采用SPSS16.0软件完成,多重比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法。计量资料用卡方检验。P<0.05被认为有统计学意义。结果1.心肌细胞自噬活性随缺氧时间延长而增强MDC和自噬体上的酸性物质结合显示为蓝色,在自噬形成的时候会聚集成团块状。我们发现随着缺氧时间延长,心肌细胞中蓝色颗粒数量及面积均显著增多(P<0.05)。在电镜观察下,自噬体为特有的双层膜结构,内含有损伤的细胞器。结果显示,细胞内的自噬体数量随着缺氧时间延长而明显增加(P<0.05)。用,western blot检测LC3-Ⅱ和Bclinl时发现,缺氧使LC3-Ⅱ和Bclinl蛋白表达量显著增加。2.干预自噬对A/R心肌细胞生存的影响将药物预处理心肌细胞30min后,分别进行缺氧6-24h后复氧4h。在缺氧6h时,心肌细胞存活率显著下降,自噬增强剂雷帕霉素增加缺氧心肌细胞的存活率,而自噬抑制剂渥曼青霉素则降低细胞存活率。而在缺氧24h时,雷帕霉素降低心肌细胞存活率,渥曼青霉素则改善细胞生存率3.干预自噬对A/R心肌细胞凋亡和自噬性死亡的影响用Hoechst33258来染核,凋亡细胞核固缩,被染成亮蓝色。在非用药的A/R组,随着缺氧时间延长,凋亡细胞核逐渐增加。在常氧组,雷帕霉素和渥曼青霉素对细胞凋亡率无影响。但是将心肌细胞缺氧6h、24h,复氧4h组,雷帕霉素处理组均可使心肌细胞凋亡率下降,而渥曼青霉素增加凋亡。然而用电镜观察细胞自噬性死亡,结果发现在缺氧6h的A/R组,雷帕霉素和渥曼青霉素对自噬性死亡无明显影响,而在缺氧24h的A/R组,雷帕霉素增加自噬性死亡,渥曼青霉素则抑制之。4.干预自噬对线粒体功能的影响用钙黄绿素和氯化钻共孵育的方法来检测心肌细胞mPTP开放情况,随着缺氧时间延长,流式细胞仪检测到的线粒体平均荧光强度下降,表明心肌细胞线粒体转换孔开放增加。用激光共聚焦检测细胞内绿色荧光强度,增加则表明mPTP开放降低,线粒体功能稳定。结果与流式细胞仪检测结果一致。荧光探针JC-1可以作为线粒体膜电位的指示剂,其红/绿荧光的比值可以反应线粒体膜电位的变化情况。结果发现随着缺氧时间延长,线粒体红/绿荧光比值逐渐下降,表明线粒体膜电位除极化增加。雷帕霉素和渥曼青霉素不明显改变常氧心肌细胞mPTP的开放程度。在轻度缺氧时(6h),雷帕霉素可降低mPTP的开放,而渥曼青霉素作用相反。但在缺氧24h的A/R组,雷帕霉素由于增强自噬而导致线粒体数量减少,从而降低线粒体内的荧光强度,而渥曼青霉素仍会继续增加mPTP的开放。5.干预自噬对I/R心肌细胞LDH释放及心梗面积的影响小鼠心肌缺血15min及40mmin,再灌注24h时,加上缺血24h共三组,心梗面积和血清LDH依次增加。在缺血40min I/R组,雷帕霉索可显著缩小心梗面积、减少LDH的释放,湃曼青霉素的作用效果相反。在缺血24h纠,雷帕霉素反而增加心梗面积,而渥曼青霉素则缩小之。电镜检测显示各组的自噬水平也是依次增加,雷帕霉素增加心肌细胞自噬,而渥曼青霉素则抑制之。结论1.缺氧或缺血时间延长可导致心肌细胞自噬活性增强,提示自噬活性与损伤程度关联。2.在自噬水平较低时,适当增加自噬对心肌细胞起保护作用,其机制可能与促进细胞垃圾清除,降低线粒体转换孔的开放,从而抑制细胞凋亡有关。3.在细胞损伤严重,自噬活性较强的情况下,进一步增加自噬可促进自噬性细胞死亡,而抑制自噬反而能增加心肌存活、限制梗塞面积。