蓝舌病(Bluetongue disease,BT)是由库蠓传播的反刍动物急性病毒性传染病,其病原蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Obivirus)成员。蓝舌病的暴发对国际贸易中的动物和动物产品产生严重的社会经济后果,但世界各国尚未研制出十分有效的疫苗,且无有效的防治措施。因此,使用准确的早期检测手段,及时隔离和处理已感动物,是减少经济损失的关键。在这种情况下,加强我国的蓝舌病病原学监测工作显得尤为重要。目前,本实验室建立的蓝舌病病毒核酸实时荧光RT-PCR检测体系、核酸RT-PCR检测体系和抗原捕获ELISA检测体系均已完成灵敏度、特异性、重复性和符合率等方面评价。本研究的主要内容是使用上述BTV检测体系及OIE标准巢式RT-PCR检测方法针对BTV全病毒进行平行检测,然后对检测结果进行比较分析。通过以上研究分析,旨在为临床样品检测提供可信的实验指导依据,便于对蓝舌病做出及时有效地诊断。一、BTV-5的培养将本实验室保存的BTV-5接毒BHK-21细胞,通过细胞病变效应(CPE)、纯化病毒形态观察和本实验室研制的蓝舌病病毒核酸RT-PCR检测体系对培养得到的BTV-5进行鉴定。取BTV-5毒液进行TCID50测定,结果为10-2.83/0.1mL。使用DMEM培养液将毒液进行倍比稀释:1:22~1:221,将其作为BTV阳性检测样品。利用本实验室保存的鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)-5标准参考株作为特异性参考品。二、四种BTV检测体系对BTV-5全病毒检测的评价对蓝舌病病病毒核酸实时荧光RT-PCR检测体系、核酸RT-PCR检测体系、OIE标准巢式RT-PCR检测方法和抗原捕获ELISA检测体系进行特异性和灵敏度评价。试验结果表明,(1)蓝舌病病毒核酸实时荧光RT-PCR检测体系特异性好,与亲缘最近的EHDV-5无交叉反应,并且对BTV-5全病毒的检出限为3.3TCID50/mL(。2)蓝舌病病毒核酸RT-PCR检测体系特异性好,与亲缘最近的EHDV-5无交叉反应,并且对BTV-5全病毒的检出限为3.3TCID50/mL。(3)OIE标准巢式RT-PCR检测方法特异性好,与亲缘最近的EHDV-5无交叉反应,并且对BTV-5全病毒的检出限为6.4×10-3TCID50/mL。(4)抗原捕获ELISA检测体系特异性好,与亲缘最近的EHDV-5无交叉反应,并且对BTV-5全病毒的检出限为211.3TCID50/mL。三、各BTV检测体系比较评价将各项检测数据汇总,对各检测体系从特异性、灵敏度、实验耗时和仪器使用情况等方面进行评价。结果表明,(1)在特异性方面,4种检测体系与BTV亲缘关系最近的EHDV-5无交叉反应,特异性好。(2)在灵敏度方面,3种核酸检测体系(核酸实时荧光RT-PCR检测体系、核酸RT-PCR检测体系、OIE标准巢式RT-PCR检测方法)均优于抗原捕获ELISA检测体系,检出限间的差距均在2个数量级以上。(3)在实验耗时和仪器使用方面,3种核酸检测体系(核酸实时荧光RT-PCR检测体系、核酸RT-PCR检测体系、OIE标准巢式RT-PCR检测方法)与抗原捕获ELISA检测体系相比,检测耗时长、使用的仪器种类多、对实验室的设备条件要求较高。(4)核酸实时荧光RT-PCR检测体系较其他2种核酸检测体系操作简便,不需繁琐的电泳,使用荧光定量检测仪即可完成从PCR扩增到结果信号采集的全部过程,这样就极大地避免了污染的发生,减小了假阳性的几率。(5)OIE标准巢式RT-PCR检测方法利用两套PCR引物对目的基因进行两轮PCR扩增反应。在提高特异性和灵敏度的同时,也增加了操作的复杂程度和检测时间。