植物病害,尤其是由真菌病原菌引起的真菌病害,一直都是农林业生产中的一个非常棘手的问题,给人类造成了巨大的损失。目前,对植物真菌病害防治还没有行之有效和安全的方法。研究发现,植物内生菌对植物病原菌有较好的抑制作用,并且已引起生物防治研究者的高度关注。本实验以药用植物内生菌为研究对象,通过平板对峙等抑菌实验,筛选对植物真菌病害病原菌有抑制作用的拮抗菌株,检测拮抗菌株的几丁质酶等几种酶的活性,并对植物内生菌的几丁质酶基因进行克隆、序列分析及外源表达载体构建,以期为植物真菌病害的生物防治和为植物基因工程育种提供多元化的外源功能基因方面提供丰富的微生物资源。实验的结果如下：1、采用选择性分离法,从27种药用植物材料中分离获得了412株植物内生菌。利用平板"cross-plug"法,检测了分离获得的412株植物内生菌对栗疫菌(板栗疫病病原菌)、小穴壳菌(苹果轮纹病病原菌)的抑菌活性。结果表明,其中94株菌对两种病原菌表现出不同程度的抑菌活性,占分离总菌株的22.82%。其中有48株表现出很好的抑菌效果(抑菌半径≥1.Ocm),而且有1株菌(1号菌)的抑菌半径达到了2.0cm,表现出很强的抑菌效果。抑菌谱分析表明,其中有18株对一种指示菌有抑制效果,19株对两种指示菌有抑制效果,11株对三种指示菌有抑制效果,12株对四种指示菌有抑制效果,5株对五种指示菌均有抑制效果。为生物防治和基因工程育种提供了丰富的菌种资源。2、16SrDNA序列分析结果表明：本实验分离得到的植物内生菌显示出来很丰富的多样性。94株拮抗菌株中链霉菌属Streptomyces,总共51株,占拮抗菌株的54.26%；芽孢杆菌属Bacillus共有14株,占拮抗菌株的14.89%；假单胞菌属Pseudomonas共有11株,占拮抗菌株的11.70%；棒状杆菌属Microbacterium共有5株,占拮抗菌株的5.32%；募养单胞菌属Stenotrophomonas和赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus各有3株,分别占拮抗菌株的3.19%；苍白杆菌属Ochrobactrum、根瘤菌属Rhizobium和短杆菌属Brevibacterium各有2株,分别占拮抗菌株的2.13%。聚类分析结果表明：编号为80、82和88的菌株与亲缘关系最近的种的相似度小于99%,通过构建系统发育树,它们形成了独特的亚种。3、拮抗菌株酶活性检测结果表明：94株拮抗菌株的几丁质酶和葡聚糖酶活性具有较大的差异。茯苓粉培养基筛选到33株产葡聚糖酶的活性菌株,并检测到有葡聚糖活性,但由于透明圈大小并不明显,活性很弱；55株菌含有编码聚酮合成酶的基因,占拮抗菌株的58.5%；目前所得的结果表明实验筛得的拮抗菌株在植物真菌病害的生物防治和植物基因工程育种方面具有很大的潜力。胶体几丁质培养基筛选到23株产几丁质酶的活性菌株,其中有7株菌株的单位菌落透明圈大小达到2.0以上,15号和60号菌株更是达到3.0以上,几丁质酶活性很强。4、利用TAIL PCR技术,成功地从36号拮抗菌中克隆了几丁质酶基因,序列分析表明,该基因的总长度为1878bp,编码623个氨基酸的几丁质酶基因开放阅读框,前47个氨基酸为信号肽。BLAST分析结果表明：与该基因碱基序列同源性最高的是菌株S. griseus几丁质酶基因(Chi Ⅲ),同源性为91%,氨基酸序列同源性最高的是菌株S.griseus几丁质酶(Chi Ⅲ),同源性为86%。5、成功地构建了PET-22b(+)几丁质酶基因的表达质粒,为后期进一步将几丁质酶基因导入植物细胞进行表达以及植物基因工程育种,提供了理论依据和实践基础。