中国恶性肿瘤总死亡率较全世界平均水平略低,而消化器官肿瘤死亡率却高出全世界平均水平近1倍。我国常见的九种恶性肿瘤中,消化系肿瘤就有胃、肝、食管、结直肠癌四种,特别是肝癌,死亡率居世界之首,可见消化器官肿瘤对我国居民危害之大,因此逐步探明消化系肿瘤的发生机制并采取有效的干预措施进行预防和治疗就尤为重要。熊果酸在诸多天然植物中以游离或复合物的形式存在,国内外多项研究表明熊果酸具备多种药效学作用,在对抗恶性肿瘤方面也是极具应用价值,多项研究表明熊果酸具有对抗肺癌,乳腺癌,胃癌,结肠癌和肝癌的广泛抗癌活性,其抗癌机制的研究主要是集中于凋亡通路等方面。近来有研究提出肿瘤的发生源起于其自身独特的代谢活动,那么,熊果酸的抗癌效应是否会与干预癌细胞的代谢活动有关就非常值得深入研究,而这也是本研究的重点所在。本研究中我们将实验分成三部分,即人体标本对比分析,动物造模对比分析以及离体细胞药理实验,前两部分重点在于通过分析比较对照组和肿瘤组之间相关指标的差异来初步揭示消化系肿瘤中相关信号通路的异常变化规律,第三部分作为这次研究的主体内容,着重探明熊果酸对消化系肿瘤细胞的药效学作用和药效学机制。第一部分人体胃肠癌组织中糖酵解通路相关蛋白表达的比较分析目的：肿瘤细胞的有氧糖酵解活动是肿瘤组织区别于正常组织的一个重要特征,PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α/PKM2通路与肿瘤细胞的有氧糖酵解活动密切相关,本实验通过将病理诊断明确的胃癌和大肠癌患者的病变组织与非肿瘤患者的相应组织进行对比分析,旨在初步阐明PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α/PKM2通路的异常变化规律。方法：收集2012年1月至2013年5月武汉大学人民医院胃肠外科胃癌和大肠癌病人手术切除且病理确诊的胃癌,大肠癌标本,其中胃癌共82例,大肠癌共105例,另外从武汉大学人民医院消化内镜中心收集内窥镜取材标本中活检正常的胃肠组织标本共92例,其中胃部正常组织48例,大肠正常组织44例。所有标本取回后均在4%多聚甲醛中固定三天后行石蜡包埋制作组织切片,采用免疫组化来对比分析各组之间相关蛋白的表达差异。结果：(1)胃癌组PKM2, mTOR的平均光密度值依次为4423.18+328.77,4586.08±284.80,均显著高于对照组的相应指标(135.84±15.36,813.55±61.26),P<0.05。(2)大肠癌组PKM2, mTOR, HIF-1α及Ubiquitin的平均光密度值依次为9736.04±128.73,5165.64±391.79,4474.39+255.93,4107.99±726.33均显著高于对照组的相应指标(4031.78±477.09,1215.83±153.41,1633.00±115.55,411.08+72.18),P<0.05。结论：(1)国人胃癌组织中PKM2和mTOR的相对表达量均显著高于非肿瘤人群。(2)国人大肠癌组织中PKM2, mTOR, HIF-1α及Ubiquitin的相对表达量均显著高于非肿瘤人群。第二部分裸鼠大肠癌模型糖酵解通路相关蛋白表达的比较分析目的：通过手术建立裸鼠BALB/c-nu大肠癌模型,通过将荷瘤模型组与对照组进行比较分析旨在探讨糖酵解通路相关蛋白在裸鼠荷瘤动物模型中的变化规律。方法：20只8周龄雄性BALB/c-nu裸鼠依据实验设计随机分为2组：(1)正常对照组；(2)大肠癌LOVO细胞原位接种裸鼠荷瘤模型组。造模期间每周监测两组动物的生存状态及相关生理指标,腹部是否可以触及实质性瘤块。原位接种第8周后处死所有动物,取出大肠组织,一部分置于4%多聚甲醛中固定做石蜡包埋用于免疫组织化学染色；另一部分置于液氮中冷冻保存用于免疫印迹的蛋白检测。结果：(1)大肠癌LOVO细胞于裸鼠大肠原位接种至最后完成造模时,荷瘤组先后共有2只意外死亡,裸鼠大肠原位种植肿瘤模型成功率为80%。(2)荷瘤组PKM2, HIF-1α的平均光密度值依次为5223.99±742.60,1601.65+224.54,均显著高于对照组的相应指标(2215.85±184.28,466.77+31.34),P<0.05。(3)荷瘤组PKM2, PI3K, mTOR的平均灰度值依次为1252.51±51.90,1109.69±19.87,917.46±48.98,均显著高于对照组的相应指标(298.35±32.54,383.72±20.80,398.28±14.68),P<0.05。结论：(1)动物大肠组织免疫组化结果的对比分析发现荷瘤组PKM2及HIF-1α的表达明显高于对照组(2)动物大肠组织western blot的结果两组对比分析发现荷瘤组PKM2, PI3K, mTOR的相对表达量显著高于对照组。第三部分熊果酸对消化系肿瘤细胞的增殖和迁移的抑制作用及其对糖酵解相关通路的影响目的：通过将熊果酸按照一定梯度浓度作用于消化系三种不同的癌细胞系,即胃癌HGC-27细胞,肝癌SMMC7721细胞,大肠癌LOVO细胞来系统的阐明熊果酸对消化系肿瘤细胞的药效学作用和药效学机制。方法：设立Oμmol/l剂量组作为阴性对照,将熊果酸以四种浓度梯度(5mol/l10μmoL/l,20μmol/1,40μmol/1)作用于三种癌细胞,并通过以下方法进行五组相关指标的检测：(1)通过MTT法检测不同浓度的熊果酸对三种癌细胞的抑制效应；(2)运用流式细胞术检测各剂量组癌细胞的凋亡率和周期阻滞；(3)选用划痕实验检测多个剂量组癌细胞的迁移能力；(4)运用western blot检测各剂量组PI3k, Akt, mTOR, HIF-lα, PKM2的表达量的差异；(5)运用Real time PCR检测主要剂量组PI3k, Akt, mTOR, HIF-1α, PKM2的mRNA相对表达量的差异。结果：(1)熊果酸在lOμmol/l以上剂量开始对三种癌细胞产生增殖抑制效应,对HGC-27细胞的半数抑制浓度IC50在12小时,24小时,48小时依次为51.89μ mol/L,37.07μ mol/L,28.19μ mol/L;对SMMC7721细胞的半数抑制浓度IC50在12小时,24小时,48小时依次为66.66μ mol/L,57.42μ mol/L,35.58μ mol/L;对LOVO细胞的半数抑制浓度IC50在12小时,24小时,48小时依次为63.69μ mol/L,46.02μ mol/L,38.39μ mol/L。(2)从10μ mol/l以上剂量组开始,三种癌细胞的凋亡率逐渐增加,高剂量组出现较为明显的G1和G2期阻滞,24小时同剂量组凋亡率和周期阻滞率高于12小时同剂量组。(3)随着给药浓度的增加,24小时后三种细胞各给药组均出现不同程度的细胞迁移活动受限。(4)四种梯度的药物作用于三种癌细胞后,20-40μ mol/L的剂量组均出现显著的PKM2表达量下调,PI3k, Akt, mTOR, HIF-1α的表达则因细胞种类的不同而在各自对应的剂量组出现显著性高表达,P<0.05。(5)在HGC细胞中,40μ mol/L组Akt,P13K的mRNA表达量明显高于对照组,SMMC细胞和LOVO细胞中,各蛋白对应的mRNA均出现一定的增长,但趋势不明显。结论：(1)熊果酸可以有效抑制人胃癌细胞,肝癌细胞和大肠癌细胞的增殖。(2)熊果酸可以促进三种消化系肿瘤细胞的凋亡并产生G2期阻滞效应,这些效应均呈现剂量和时间依赖性。(3)熊果酸可有效抑制消化系肿瘤细胞的迁移活动。(4)熊果酸通过特异性阻遏PKM2的表达来发挥抑制消化系肿瘤细胞增殖并促进其凋亡的作用,同时熊果酸对已经活化的PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α通路再次激活引起肿瘤细胞内稳态的扰乱诱导肿瘤细胞的凋亡及坏死。