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L-(+)-酒石酸是一种重要的羟基羧酸类螯合剂,在制药、食品、染料等工业中有着广泛的应用。目前,L-(+)-酒石酸主要来源是酿酒行业中“酒石”的提取,或者利用顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase, ESH)进行酶法生产制备。前者受到原料的限制,而后者主要依赖于底物马来酸酐,是一种以石化产品为原料的生产方式。进入21世纪以来,世界范围内石油资源的日益枯竭,以及国际原油价格的不稳定,这对以石油为原料的化学品制造业造成了巨大的压力,也使以生物质可再生资源为原料的可持续生产加工方式在全球范围内引起了广泛的关注。本论文在综述L-(+)-酒石酸的性质、用途、市场需求、生产方法及生物制造研究进展等内容的基础上,针对以糖类为原料的生物转化-化学催化级联制备L-(+)-酒石酸过程中反应选择性不高、产物综合得率低等问题,系统性地研究了5-酮-D-葡萄糖酸(5-KGA)高效合成Gluconobacter oxydans细胞工厂的构建、发酵过程优化与控制,以及5-KGA化学催化氧化制备L-(+)-酒石酸的工艺,提高了工艺的总体效率,为利用可再生资源生物制备L-(+)-酒石酸打下基础。本文首先在分析氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans DSM2343生物合成5-KGA代谢途径的基础上,利用自杀质粒pJKM,通过同源重组方式,先后无痕敲除葡萄糖酸-2-脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因,切断2-KGA和副产物乙酸的代谢途径,构建工程菌G. oxydans ZJU2。通过摇瓶实验,该菌5-KGA的产量为20.89g/L,是出发菌株的2.65倍。通过分析工程菌G. oxydans ZJU2分批发酵过程动力学参数μ、qs、qp变化特性,设计一种简单、易操作的分阶段溶氧控制策略,以获得较高比生长速率,实现5-KGA高产量、高产率的相对统一。在15-L发酵罐上,起始葡萄糖浓度为100g/L,最终细胞干重为3.8 g/L,5-KGA的产量约为75.66g/L,产率为1.72g/L·h,摩尔转化率为70.21%,然而发酵体系中仍有23.19g/L的葡萄糖酸残余,占初始葡萄糖的摩尔比为21.29%。较高的中间产物葡萄糖酸积累量表明,葡萄糖酸向5-KGA转化的反应成了代谢途径的限速步骤,过表达催化该反应的酶可能有利于提高5-KGA的发酵水平。在优化表达系统启动子元件的基础上,分别克隆表达Gluconobacter的山梨醇脱氢酶基因及Xanthomonas campestris DSM3586的次级醇脱氢酶基因,对比分析工程菌G. oxydans ZJU2/pBB5-P0.169-gcd和G. oxydans ZJU2/pBB5-P0.169-sldAB合成5-KGA的能力。发酵64 h后,5-KGA的产量分别为119.14 g/L和123.78g/L,产率分别为1.86g/L·h和1.93 g/L-h,摩尔转化率分别为73.71%和76.58%。结果表明工程菌G. oxydans ZJU2/pBBR5-P0.169-sldAB (G. oxydans ZJU3)更适合于5-KGA的合成。过表达依赖于辅酶PQQ的膜结合sldAB基因后,会造成宿主菌本身PQQ的水平和酶量之间的不平衡,从而限制sldAB基因表达的效果。利用穿梭质粒pUCpr,在G. oxydans ZJU3中进一步强化辅酶PQQ合成模块及呼吸链电子传递模块,最终工程菌G. oxydans ZJU7,其PQQ水平达757.83±2.43μg/L, H+/O为2.01±0.16,醌醇氧化酶活力为0.80±0.06μmol/min·mg protein,同时5-KGA的批次发酵最高产量为144.52 g/L,摩尔转化率约为84.07%,产率为2.26 g/L·h(以发酵64h计算)。进一步对工程菌发酵体系进行过程控制优化,如起始葡萄糖浓度、氮源、pH、溶氧DOT、Ca2+等。在此基础上,考察工程菌G. oxydans ZJU7流加补料条件,建立葡萄糖Fed-batch发酵工艺,发酵64h后,5-KGA的产量达到162g/L,摩尔转化率为83.31%,产率为2.53 g/L·h。以5-KGA为研究对象,考察碱性缓冲体系下化学催化5-KGA制备L-(+)-酒石酸的工艺。通过筛选,确定CuSO4·5H2O为催化剂,并优化其用量、反应温度、反应时间等。在30℃,220rpm, CuSO4·5H2O用量为0.5 g/L的条件下,100 g/L的5-KGA-K在碱性缓冲体系中连续反应72h,5-KGA的摩尔转化率可以达73%-75%,选择率约为76.18%,相对于传统的NH4VO3、贵金属Pd-C等催化剂,具有成本低、无毒害、高效率等特点。最后考察CuSO4·5H2O催化过程特征官能结构的变化、紫外吸收的变化、以及Cu2+与5-KGA的配位数等,结合抗坏血酸氧化过程,提出不同于NH4VO3催化氧化的假设性机理。以可再生原料出发,生物发酵-化学催化级联反应制备L-(+)-酒石酸可摆脱对石化资源的依赖,实现工业原料的战略转移,对提升我国酒石酸产业及其国际竞争力具有重要战略意义。