第一章 通过单个卵细胞实时定量PCR对原始卵泡激活机制的研究目的:早期卵细胞体积较小并且与周围颗粒细胞结合紧密难以分离,以往对于早期卵泡发育的研究常选用卵巢组织为实验对象,易受到卵巢中其它类型细胞的干扰。因此,本研究首次使用单细胞qPCR技术对卵泡激活过程中卵细胞的基因表达变化进行研究,排除其它细胞对实验结果的干扰,更准确的研究卵泡的激活机制,并对卵泡激活相关的信号通路及调节因子进行预测。方法:在Ingenuity Pathway Analysis(IPA)数据库中搜索与卵泡发育及POF的相关基因,然后结合Ovarian Kaleidoscope Database(OKdb)数据库进行筛选,共选择91个候选基因及5个内参基因,设计定制Taqman array card芯片。利用单细胞分离提取系统,挑取小鼠40个原始卵泡的卵细胞及40个初级卵泡的卵细胞进行单细胞qPCR。随后采用StatMiner软件对qPCR的结果进行分析,选取表达差异大于5倍的基因导入IPA中进行Core analysis。通过软件对卵泡激活相关的信号通路及上游因子进行预测。结果:通过StatMiner软件对基因表达进行分析,结果显示卵泡激活前后卵细胞基因表达差异明显。聚类分析及主成分分析(PCA)均将两时期的卵细胞明显分为两组。用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对差异基因进行Core analysis后我们发现排名第一的信号通路为PTEN信号通路(P = 8.92×10-6)。通过对差异基因构成的信号网络进行分析得出,对其影响最大的基因为Rela。结论:利用单卵细胞qPCR结果可以明显区分原始卵泡及初级卵泡的卵细胞。通过数据分析我们推测,PTEN信号通路为卵泡激活中相关性最高的信号通路。此外在对差异基因构建的网络中分析得出,得分最高的上游因子为Rela,推测其可能为卵泡激活相关基因。第二章Re l a基因对卵泡激活过程的影响及颗粒细胞qPCR实验中最佳内参基因选择第一节Re la基因对卵泡激活过程的影响目的:通过上一章单个卵细胞qPCR的结果,我们推测Rela基因可能为卵泡激活的相关基因。RELA蛋白是NF-lkB复合体的一个亚基,NF-kB作为一个重要的转录因子参与多个生物进程的调控。但目前还没有关于该基因在卵泡发育中作用及功能的报道。本章利用小鼠卵巢体外培养系统及线虫模式动物等,对Rela在卵泡激活过程中的作用进行研究,并对其在卵巢细胞中的作用机制进行初步探讨。方法:通过免疫组化对Rela在小鼠卵巢细胞中的表达进行定位。分别选择Rela基因激动剂、抑制剂及siRNA等对体外培养的小鼠卵巢及颗粒细胞进行干预,通过卵泡计数观察卵巢表型变化。通过Western blot及微量细胞qPCR对卵巢细胞蛋白及基因表达情况进行观察。此外,通过线虫培养检测Rela的激动剂和抑制剂对线虫产卵数的影响。结果:通过免疫组化可以观察到Rela在各时期卵细胞及颗粒细胞中均有表达,但在膜间质细胞中不表达。通过小鼠卵巢体外培养可以观察到,上调Rela及激活NF-kB通路后,原始卵泡的比例明显减少,生长卵泡的比例增加。而Rela的下调则会导致原始卵泡的比例增加、生长卵泡比例下降及闭锁卵泡数量的增多。微量细胞qPCR结果显示在卵细胞中激活NF-kB通路可使Gdf9表达升高,Pten表达降低,而抑制Rela基因可导致Nobox及Bcl2l1等基因的下调。在原代颗粒细胞中上调及下调Rela后,在蛋白水平及RNA水平均可观察到NF-kB通路下游基因116、Bcl2l1等表达的明显改变。此外,Rela激动剂及抑制剂处理线虫后,可观察到其产卵数的改变。结论:Rela在各时期卵泡中均有表达,且对小鼠及线虫的生殖发育均有调控作用。实验结果显示,NF-kB及Rela可能通过影响Pten信号调控卵泡的激活,也可能通过调控卵细胞及颗粒细胞的凋亡影响原始卵泡的闭锁。此外,我们推测RELA与AKT之间存在复杂的相互作用,共同影响着卵泡激活过程的平衡。第二节 卵巢颗粒细胞qPCR实验中最佳内参基因的选择目的:卵巢颗粒细胞在卵泡发育及卵巢疾病中均扮演着重要的角色,是生殖研究中最常用的细胞类型。在基因表达实验中,内参基因的选择对实验结果的准确性起着至关重要的作用。然而目前仍未有关于小鼠及人卵巢颗粒细胞最佳内参基因选择的报道。因此,本研究通过三种内参基因表达稳定性评估算法,分别对小鼠及人类颗粒细胞的内参基因进行评估。从而选择出在小鼠及人类颗粒细胞qPCR基因定量实验中最合适的内参基因及组合。方法:收集不同药物处理后小鼠原代颗粒细胞及PCOS患者和对照女性的原代颗粒细胞,提取RNA。选择15个常用内参基因作为候选基因,使用qPCR分别对收集的小鼠及人类原代颗粒细胞进行内参基因的表达检测,随后使用三种统计算法:GeNorm、NormFinder和BestKeeper对所选内参基因的稳定性进行评估,通过对三种算法结果进行综合评分,最终确定颗粒细胞基因表达研究中的最佳内参基因和组合。结果:通过对三种内参基因表达稳定性算法的结果进行综合分析,我们发现在15个候选内参基因中,不同条件处理的小鼠颗粒细胞中稳定性最好的三个内参基因为Hprt、Tfrc和Rplp0。在PCOS患者及正常对照女性颗粒细胞中,最稳定的三个内参基因为HPRT1、RPLP0和HMBS,且同时使用三个内参进行标准化效果最佳。在小鼠及人颗粒细胞中均是最稳定的内参为Hprt/HPRT1,结论:本实验首次对小鼠及人类卵巢颗粒细胞在qPCR实验中内参基因的选择进行了研究。我们发现颗粒细胞内参基因的稳定性会受到不同实验条件及疾病的影响。通过分析我们推荐Hprt作为小鼠颗粒细胞的最佳内参。在PCOS颗粒细胞的研究中,推荐同时使用HPRT1、RPLP0和HMBS三个内参进行标准化效果最佳。通过综合分析,我们推荐Hprt/HPRT1基因为不同条件下颗粒细胞中最稳定的内参。本研究为今后小鼠及人颗粒细胞qPCR基因表达实验中内参基因的选择提供了最佳选择及实验依据。第三章 利用单细胞转录组测序对卵泡激活机制的研究目的:在第一章中,通过单卵细胞qPCR,我们对激活前后卵细胞基因表达谱变化进行了初步研究,然而TaqMan芯片能检测的基因数目有限,不能对整个转录组的变化进行分析。因此,我们采用单细胞转录组测序(scRNA-Seq)技术对卵泡激活过程中卵细胞整个转录组的变化进行研究。从而更准确的了解卵泡激活过程,构建卵泡激活的信号网络,并且对早期卵泡的异质性进行研究。方法:首先用单细胞分离提取系统分别挑取36个小鼠原始卵泡和36个初级卵泡的卵细胞,然后采用SMART-Seq的方法对单个卵细胞中的mRNA进行反转录及扩增,利用磁珠对cDNA进行纯化,质量控制后选择合格的样品采用Illumina HiSeq 4000平台进行测序。测序数据进行质控过滤后,对差异基因进行描述及分析,通过聚类分析及PCA观察样本之间的关系,通过信号通路分析、疾病富集分析、GO富集分析等,对卵泡激活过程进行研究。结果:我们对质量合格的68个卵细胞样品进行了建库测序,通过数据质控过滤掉两个线粒体基因过多的样品。然后对剩余的66个细胞进行生物信息分析,过滤低丰度表达基因后,共有14869个基因被检测到。结果显示,卵泡激活过程中卵细胞的基因表达明显改变,通过PCA及聚类分析,可见两时期卵细胞明显分为两组,且原始卵泡卵细胞个体之间差异性较大。通过生物信息分析得出,mTOR信号为卵泡激活过程中相关性最高的信号通路。通过疾病及功能紊乱富集分析推断,卵泡激活过程中差异基因与肿瘤及生殖疾病的发生关系密切。此外,通过差异基因的网络构建,我们对卵泡激活相关基因进行了预测。结论:本研究首次通过scRNA-Seq技术对卵泡激活过程中卵细胞转录组的基因变化进行了研究。通过生物信息分析,我们预测mTOR信号为卵泡激活过程中相关性最高的信号通路,通过差异基因的网络构建,我们进一步对卵泡激活的相关基因进行了预测,为下一步卵泡激活机制的功能研究提供了方向。