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银屑病祖国医学又称之为“白庀”,是一种临床常见的慢性复发性皮肤病。临床表现具有多样性,主要特征为红斑、鳞屑等。银屑病发病机制复杂,具有多基因遗传背景,同时受到环境因素的影响,多种免疫细胞及炎症性细胞因子参与其中。目前关于银屑病的确切发病机制仍未明确,但大量证据显示,免疫细胞尤其是T淋巴细胞功能失调在本病发病过程中起到重要作用。淋巴细胞活化过程中除需要MHC-肽-TCR复合体给予第一信号外,第二信号即共刺激信号在后续活化及功能维持方面起重要作用。共刺激分子在多种疾病如免疫性疾病、肿瘤等的发病过程中,通过影响淋巴细胞功能参与疾病的发生发展。共刺激分子根据其主要功能可分为正性共刺激分子和负性共刺激分子两类,分别对T细胞产生刺激性及抑制性作用,其中抑制性分子的受体又称免疫检查点,可以通过与其配体特异性结合抑制T细胞过度活化及增殖,在维持免疫稳态方面发挥关键作用。T cell immunoglobulin and ITIM domain(TIGIT)是最近发现一种免疫毒性显著低于CTLA-4、PD-1等的共抑制分子。有研究显示,激活CD4+T细胞上TIGIT信号通路后,可抑制CD4+T细胞增殖及功能。因此,我们推测通过干预TIGIT信号通路,可能抑制银屑病患者外周血CD4+T细胞增殖及其功能,从而为银屑病的治疗提供新方法和新思路。明清以后,“血分论治”已成为银屑病辨证论治的主要理论依据。经过多个大样本的流行病学研究发现“血热证”在银屑病所有证型中的发病率位居第一。因此白彦萍教授在根据自己多年临床经验的基础上,研制出针对血热型银屑病的方药-清热凉血方,其临床有效性本课题组前期已通过临床研究、细胞及动物模型研究得以证实。由于中药复方可通过影响多个靶点发挥临床作用,因此优选出最佳靶点成为研究中药复方的热点和重点。目的:观察血热型银屑病患者外周血及皮损中TIGIT+CD4+T细胞及其相关细胞因子的表达情况,分析TIGIT表达水平与血热型银屑病疾病严重程度(Psoriasis area and severity index,PASI)的相关性。观察干预TIGIT信号通路是否能够影响银屑病患者外周血CD4+T细胞增殖和功能。观察清热凉血方是否可以通过影响血热型银屑病患者外周血CD4+T细胞上TIGIT表达水平发挥治疗作用,探讨TIGIT在银屑病免疫发病过程中的作用机制以及清热凉血方通过干预TIGIT表达治疗血热型银屑病的临床意义。方法:入组28名血热型银屑病患者和14名健康对照者。运用流式细胞技术、实时荧光定量PCR技术检测两组外周血CD4+T细胞上TIGIT的表达情况,运用免疫组织化学和免疫荧光的方法观察血热型银屑病患者皮损区、非皮损区皮肤组织和健康对照者皮肤组织中CD4+T细胞表面TIGIT的表达情况,用CBA技术检测两组血浆中IFN-γ、IL-17A、IL-10的表达水平,分析TIGIT+CD4+T细胞表达与银屑病严重程度及与IFN-γ、IL-17A、IL-10含量的相关性。观察抗anti-CD3/CD28抗体刺激CD4+T细胞活化增殖的最佳时间和浓度;通过采用 functional anti-human TIGIT antibody 和 recombinant human CD155/Fc protein干预TIGIT信号通路,观察CD4+T细胞增殖情况和IFN-γ、IL-17A、IL-10表达水平。此外,给予8例中重度血热型银屑病患者(PASI>10)清热凉血方治疗,观察治疗2个月后PASI评分,TIGIT+CD4+T细胞表达频率及IFN-γ、IL-17A、IL-10的变化特点。结果:(1)TIGIT+CD4+T细胞表达频率在血热型银屑病患者外周血中较健康人显著降低,二者差异具有统计学意义(P<0.05),但皮损中TIGIT+CD4+T细胞免疫组织化学及直接免疫荧光染色阴性。血浆中IFN-γ、IL-17A含量显著高于健康人,差异具有显著统计学意义(P<0.01,P<0.01),而 IL-10 反之(P<0.05);TIGIT+CD4+T 细胞表达频率与 PASI、IFN-γ、IL-17A 呈负相关(r=-0.49,P=0.0149;r=-0.49,P<0.01;r=-0.72,P<0.01),和IL-10呈显著正相关(r=0.62,P=0.0004)。(2)使用5ug/ml anti-CD3抗体包被96孔板后加入2ug/m anti-CD28抗体刺激CD4+T细胞,培养48小时时细胞分裂增殖能力强。使用recombinant human CD155/Fc protein激活TIGIT信号通路后,CD4+T细胞分泌IFN-γ、IL-17水平较同行对照组及functional anti-human TIGIT antibody 组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05)。IL-10水平较同行对照组及functional anti-human TIGIT antibody组显著升高(P<0.05)。而使用 functional anti-human TIGIT antibody 阻滞 TIGIT 信号通路后,细胞上清中 IFN-γ、IL-17水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.05);但细胞上清中IL-10未见明显差异(P>0.05)。并且使用 recombinant human CD155/Fc protein 激活 TIGIT 信号通路后,能够显著抑制CD4+T细胞增殖,差异具有统计学意义(P<0.01)。(3)使用清热凉血方后,血热型银屑病患者PASI、IFN-γ以及IL-17A表达水平较治疗前显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。TIGIT+CD4+T细胞表达频率和IL-10表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。结论:TIGIT在血热型银屑病患者外周血CD4+T细胞中呈低表达状态,其与银屑病疾病严重程度也具有显著相关性。通过激活TIGIT信号通路,可抑制CD4+T细胞增殖以及细胞因子IFN-γ和IL-17A的表达。提示在银屑病发生发展过程中,TIGIT信号通路可能与负性调节银屑病患者T细胞活化增殖密切相关。并且清热凉血方在促进血热型银屑病患者CD4+T细胞表面TIGIT表达的同时抑制IFN-γ和IL-17A的分泌,从而发挥治疗作用。