由指状青霉（Penicillium digitatum）引起的柑橘绿霉病（Green mold）是柑橘采后贮藏及运输过程中最为严重的病害之一。目前,主要采用一系列化学类杀菌剂进行防治,然而化学杀菌剂的使用常会带来病原菌抗性增强、农产品化学残留、环境污染等问题。因此,解析绿霉病的致病机制,发掘天然无污染抗病产品对于防治柑橘绿霉病以及柑橘产业长久发展都具有重要意义。指状青霉是一类典型的死体营养型真菌,通过引起柑橘果实坏死,而后从中吸收营养用于病原菌侵染生长。本研究在已有指状青霉c DNA文库及基因组数据基础上,以诱导坏死为目标筛选出了指状青霉第一个坏死诱导型效应蛋白PdE1（Penicillium digitatum effector 1）,并探究了其在指状青霉生长发育以及侵染致病过程中的作用。同时,本论文也对花青素和褪黑素这两种天然产物抗柑橘绿霉病能力进行了鉴定。本研究为揭示效应蛋白在绿霉病病菌致病过程中的重要作用及柑橘绿霉病病菌致病机制奠定了基础,也为绿霉病安全无污染防治新策略的发掘提供了一定理论依据。主要研究结果如下:1.效应蛋白的鉴定及功能分析通过生物信息学分析,从指状青霉侵染柑橘病理模型c DNA文库中分析并筛选出了4个候选效应蛋白,借助农杆菌介导表达系统鉴定出具有诱导烟草叶片及柑橘果实坏死的指状青霉PdE1效应蛋白。体外PDA培养基中生长时,PdE1基因在病原菌整个生命过程中呈现出低水平表达;而在侵染柑橘宿主时从侵染初期便显著上调表达。从分离病原菌的侵染柑橘总蛋白提取物中,用制备的特异性抗体检测到PdE1效应蛋白的存在,显示其是一个典型的分泌蛋白。PdE1效应蛋白是一个N端具有21个氨基酸信号肽,无明显PFAM功能结构域且富含半胱氨酸的保守蛋白,在多种植源性病原菌,特别是青霉属中高度保守且只有一个拷贝。烟草叶片和柑橘果实中瞬时表达意大利青霉及扩展青霉中的同源蛋白KGO75235.1和XP＿016597123.1也出现类似坏死诱导表型。植物坏死诱导相关物质ROS（Reactive oxygen species,ROS）和水杨酸在由PdE1诱导坏死的烟草及指状青霉侵染坏死的柑橘中都显著积累。水杨酸合成关键基因ICS沉默的烟草株叶片中瞬时表达PdE1效应蛋白依然能诱导坏死的产生,且与野生型烟草株坏死表型不存在显著差异,水杨酸也不再随坏死的发生而积累。这表明PdE1所诱导烟草叶片及柑橘果实坏死不依赖于水杨酸;外源活性氧抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine,NAC）处理,尤其是烟草叶片中瞬时表达效应蛋白PdE1之前进行处理,烟草叶片的坏死被显著抑制,这些结果表明PdE1效应蛋白诱导坏死是依赖于活性氧而不是水杨酸。借助农杆菌介导基因敲除技术对指状青霉中PdE1基因进行定点敲除,突变体无论是分生孢子产生、萌发、生长还是菌株的抗非生物胁迫能力等都与野生型菌株不存在差异。通过接种柑橘,突变体显示出显著降低的致病性,表明PdE1基因对于指状青霉的致病性存在贡献。荧光表达系统以及线粒体特异性荧光共定位显示PdE1效应蛋白定位细胞器为线粒体,且通过线粒体体外提取染色也得到验证。2.PdE1效应蛋白靶蛋白的鉴定与功能探究烟草叶片中瞬时表达PdE1-HA融合蛋白,通过IP筛选与其互作的蛋白,并通过测序获得了6个候选靶标。酵母共转化6个候选靶标进行蛋白互作验证,结果显示只有Hsp70-2（heat shock cognate 70 k Da protein 2-like,XP＿006488297.1）与PdE1存在着直接互作关系。体外表达PdE1与Hsp70-2蛋白进行共孵育,也显示PdE1与Hsp70-2蛋白之间存在直接互作。Hsp70蛋白在不同物种中具有高度保守性,烟草中Hsp70-2靶标蛋白与柑橘中Hsp70-2蛋白序列高度同源;体外表达柑橘Hsp70-2同源蛋白与PdE1蛋白进行共孵育,显示出与烟草中相似的结果。构建病毒沉默载体,对烟草中Hsp70-2靶基因进行沉默,烟草Hsp70-2沉默株系相较于野生型生长发育出现严重迟缓,叶片产生畸变;新生叶片于芽穗处便呈现出畸形弯折,在叶片伸展过程中始终弯曲不平整,叶面积也显著小于野生型。在生长发育后期,植物过早出现萎蔫坏死。测定沉默株叶片内活性氧水平,也显著高于野生型,这些结果都表明Hsp70-2基因参与了烟草正常生长发育过程,且在植株活性氧代谢过程中发挥重要作用。3.PdE1调控坏死的机制探究通过对PdE1与Hsp70-2蛋白结合区域进行分析及实验,得到PdE122-144序列是效应蛋白坏死诱导主要功能区域,且酵母共转化以及体外反应实验中这一片段都显示出与Hsp70-2靶蛋白的互作。序列分析显示Hsp70-2靶标蛋白中存在一段21个氨基酸长度的KRAVRRLRTACERAKRTLSSS序列,与多种动植物Hsp70家族蛋白所特有与Ca M钙调蛋白结合的LTS基序（PRALRRLRTACERAKRTLSST）序列高度同源。体外表达获得柑橘源Ca M蛋白与Hsp70-2蛋白LTS基序的多肽片段,非变性电泳条件下这一LTS基序在Ca2+存在条件下可与Ca M蛋白产生结合,并引起Ca M蛋白分子量的变化。通过实验分析,PdE1及PdE122-144序列与LTS多肽片段也能产生与Ca M蛋白相似的结果,且不依赖于Ca2+。验证野生型指状青霉及PdE1突变体菌株侵染柑橘后宿主内蛋白间的互作关系,显示PdE1对于Ca M蛋白结合Hsp70-2蛋白存在着显著的竞争作用。采用Fluo-3/AM对病变柑橘及烟草叶片进行染色,显示出钙离子水平随病变发展而显著升高的趋势。上述结果表明PdE1蛋白与Ca M蛋白存在相同的结合位点,且通过竞争性结合Hsp70-2而导致胞内钙离子浓度的升高,进而造成活性氧积累细胞坏死等结果。此外,PdE1也显示出对于Hsp70-2伴侣活性的抑制。4.褪黑素降低柑橘果实采后绿霉病抗性ROS积累在柑橘染病坏死过程中起着主要作用;在探究各类抗氧化剂在柑橘果实采后绿霉病防治中的作用时,显示褪黑素这一常见强抗氧化剂并不存在体外抗菌活性,相反,显著促进了病原菌在柑橘宿主上的发病致病过程。褪黑素处理柑橘后,接种Pd（Penicillium digitatum）的柑橘果实中H2O2含量和相关酶活性均下降。单独采用H2O2处理柑橘果实显著提高了柑橘果实抗病能力,同时也诱导柑橘内褪黑素含量的上升。转录组分析显示参与细胞壁、活性氧代谢和植物防御等途径的相关基因在褪黑素处理后的柑橘果实中显著下调表达,这些结果都表明了H2O2活性氧物质对于柑橘抵抗绿霉病具有重要意义,同时也显示褪黑素通过清除与防御相关的ROS,从而降低柑橘果实对于绿霉病的抗性。5.花青素促进柑橘果实对采后绿霉病的防御与褪黑素相似,花青素也是一种强力的抗氧化剂;富含花青素的塔罗科血橙相较于多种甜橙品种显示出更低的绿霉病敏感性,且在Pd侵染后的柑橘中花青素显著积累。体外实验显示花青素对于指状青霉并不存在抗菌活性,而通过提取塔罗科血橙中花青素外源处理不含花青素的柑橘品种,这些柑橘品种却表现出对于绿霉病敏感性的降低。塔罗科血橙、花青素处理的柑橘及普通柑橘中ROS都呈现出随绿霉病侵染而积累的趋势,但塔罗科血橙及花青素处理后的柑橘中ROS积累量更低,相关基因表达量也相对更低。这些结果都表明花青素抑制了柑橘ROS所诱导的坏死。同时转录组分析也显示在绿霉病侵染过程中许多可能参与植物与病原菌相互作用、花青素生物合成的基因在塔罗科血橙中显著上调表达。这些结果都表明花青素有助于柑橘果实对于绿霉病的防御,这对研究花青素在植物抗病性以及柑橘果实采后病害的控制都具有重要意义。