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为筛选出具有抗肿瘤活性的螺旋藻多肽,本文首先采用反复冻融、均质和超声联用的方法对原料螺旋藻粉进行处理,在此基础上分别比较了盐提和水提两种不同溶剂提取方式的蛋白提取率。继而利用多种酶对螺旋藻蛋白分别进行单酶解、双酶解以及体外模拟胃肠道消化的三酶解,来制备得到螺旋藻多肽,并研究了脱色对水解肽抗肿瘤活性的影响。通过超滤和凝胶色谱层析方法对制备得到的多肽进一步分离纯化。全文采用MTT法评价各多肽组分对5种肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性,采用裸鼠人肝癌Hep G-2移植瘤模型评价抗肿瘤肽D1的体内抗肿瘤活性。利用质谱技术对筛选出的螺旋藻抗肿瘤活性多肽进行分析鉴定,合成相应的肽段并验证其体外抗肿瘤活性。本研究的主要成果如下:1.采用反复冻融、均质和超声联用的方法处理螺旋藻粉,在此基础上水提法的蛋白提取率可达到84.80%,其提取率和提取蛋白的复溶性均大于盐提法。2.以胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对螺旋藻蛋白分别进行单酶解,以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双酶解,以胰蛋白酶-胃蛋白酶-胰凝乳蛋白酶进行三酶解,对其水解度及其酶解物的抗肿瘤活性分别进行测定,结果表明:水解度大小与抗肿瘤活性非线性相关。3.脱色会降低螺旋藻水解肽的体外抗肿瘤活性,推测色基的存在或色基结构的完整性是影响螺旋藻水解肽抗肿瘤活性的原因之一。4.胰蛋白酶水解肽超滤后得到T>10K、T5-10K、T3-5K和T0-3K四个组分,选取T0-3K进行凝胶色谱分离,共得到7个组分T1-T7。其中T5对胃癌细胞SGC-7901有显著的体外增殖抑制作用,其IC50值为32.37μg/m L;T3和T4对胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HT-29均有显著的抑制作用,其IC50值分别为46.43μg/m L、76.11μg/m L和<31.25μg/m L、31.25μg/m L。5.碱性蛋白酶水解肽超滤后得到A>10K、A5-10K、A3-5K和A0-3K四个组分,选取A0-3k进行凝胶色谱分离,共得到5个组分A1-A5。其中,A1对Hep G-2、SGC-7901和A549细胞有显著的体外抑制作用,其IC50值分别为47.67μg/m L、84.40μg/m L和61.22μg/m L;A2对肿瘤细胞SGC-7901有显著的体外抑制作用,其IC50值为55.77μg/m L;A3对MCF-7、Hep G-2和HT-29有显著的抗肿瘤活性,其IC50值分别为64.59μg/m L、61.65μg/m L和43.05μg/m L;A4和A5能够显著抑制肝癌细胞Hep G-2的体外增殖,其IC50值分别为79.44μg/m L和69.54μg/m L。6.木瓜蛋白酶水解肽超滤后得到P>10K、P5-10K、P3-5K和P0-3K四个组分,选取P0-3K进行凝胶色谱分离,共得到7个组分P1-P7。其中P1和P5对Hep G-2有显著的抑制作用,其IC50分别为64.94μg/m L和78.62μg/m L;P4和P6对A549有显著的细胞增殖抑制作用,其IC50值均小于实验最低剂量浓度31.25μg/m L。通过MALDI-TOF/TOF-MS对组分D4进行了鉴定,其中m/z=808.418的肽,其序列为YGFVMPRSGLWFR,分子量为1614.8130Da。相应的合成肽对A549、Hep G-2和SGC-7901的体外增值有较好的抑制作用,其IC50值分别为104.05μg/m L、188.23μg/m L和247.32μg/m L,500μg/m L时对正常肝细胞L-02的体外增殖有微弱的促进作用。7.双酶水解肽超滤后得到D>10K、D5-10K、D3-5K和D0-3K四个组分,选取D0-3K进行凝胶色谱分离,共得到6个组分D1-D6。其中,组分D1对MCF-7、Hep G-2和A549有显著的抑制作用,其IC50值分别为<31.25μg/m L、49.36μg/m L和79.32μg/m L,经质谱鉴定,D1中包含一条分子量为970.599Da,氨基酸序列为AGGASLLLLR的肽,其相应的合成肽对五种肿瘤细胞都有一定程度的抑制作用,但显著低于其来源组分D1;D2对Hep G-2和A549的细胞增殖有显著抑制作用,其IC50值分别为96.06μg/m L和99.23μg/m L;D3对MCF-7和HT-29细胞的体外增殖有显著的体外抑制作用,其IC50值均小于实验最低剂量浓度31.25μg/m L;D4对A549和HT-29的体外增殖有显著的抑制作用,其IC50值分别为45.80μg/m L和89.20μg/m L,经质谱鉴定,D4为单一肽组分,仅包含一条分子量为991.561Da,序列为KFLVLCLR的八肽,与该序列相应的合成肽相比,根据其部分序列合成的四肽LCLR对Hep G-2和HT-29的抑制效果更为显著,其IC50值分别为264.86μg/m L和224.74μg/m L;D5对SGC-7901、A549和HT-29的体外增殖都有显著的抑制作用,其IC50值分别为87.52μg/m L、61.14μg/m L和34.65μg/m L,质谱分析结果显示D5中包含一条分子量为808.481Da,氨基酸序列为LAGHVGVR的肽,但相应合成肽的抗肿瘤活性显著低于D5。8.模拟胃肠道消化的胰蛋白酶-胃蛋白酶-胰凝乳蛋白酶三酶联合水解肽超滤后得到Tr>10K、Tr5-10K、Tr3-5K和Tr0-3K四个组分,选取Tr0-3K进行凝胶色谱分离,得到4个组分Tr1-Tr4。其中,Tr1对MCF-7的IC50值为60.12μg/m L,经质谱鉴定,该组分中包含一条分子量为935.556Da,氨基酸序列为HVLSRAPR的八肽,其合成肽对HT-29有显著的抗肿瘤活性,其IC50值为99.88μg/m L;Tr2对MCF-7、Hep G-2和SGC-7901都有显著的细胞增殖抑制作用,其IC50值分别为<31.25μg/m L、36.42μg/m L和48.25μg/m L。9.体内抗肿瘤活性测定结果表明,抗肿瘤肽D1对裸鼠移植瘤的生长有一定程度的抑制作用,且剂量与抑制作用之间成量效关系;实验剂量范围内,D1的体外抗肿瘤活性与5-FU相当,但体内抗肿瘤活性与5-FU差异显著。D1对荷瘤裸鼠体质量的增长几乎无影响,毒副作用显著低于阳性对照。