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目的1.构建肝脏特异性表达的微小RNA——miR-122的真核表达载体;2.将该重组质粒在人肝癌细胞系中转录,通过现代分子生物学技术鉴定其生物活性。3.利用该重组质粒初步探讨miR-122与乙型肝炎病毒复制之间的关系。方法1.真核表达载体的构建:应用PCR技术,以从人类肝癌细胞中提取的基因组DNA为模板,获得miR-122的编码基因片段。根据设计的酶切位点,将其与真核表达载体pSuper同时双酶切,然后经T4连接酶连接,筛选得到稳定的克隆,命名为pHsa-m122。2.鉴定重组体的生物活性:以美国斯坦福大学医学院微生物与免疫教研室Peter Sarnow教授馈赠的荧光报告质粒GFP-122 sensor(GFP-122si)为报告质粒、GFP-124 sensor (GFP-124si)为无关对照质粒,该报告质粒GFP-122si的转录可被成熟的miR-122干扰,使绿色荧光蛋白的表达量下降,同样GFP-124si的转录也可被成熟的miR-124干扰,而不受成熟的miR-122干扰。因而将pHsa-m122与报告质粒GFP-122si共同转染人肝癌细胞系HepG2,以pHsa-m122与参照质粒GFP-124si共转染人肝癌细胞系HepG2为对照,分别用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达、流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度、Western blot检测绿色荧光蛋白的表达量这三种方式来检测GFP的表达变化,通过GFP蛋白表达量的下降来反映成熟的miR-122的表达情况。3.初步探索miR-122与HBV复制之间的关系:通过体外真核转染确定质粒pHsa-m122的有效性后,将pHsa-m122转染入人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞,经过24小时后,用ELISA的方法来检测细胞分泌上清中HBsAg、HBeAg的表达量。结果1.真核表达载体的构建:pHsa-m122经PCR鉴定,能够获得预期大小的目的片段; pHsa-m122经双酶切鉴定,可获得预期大小片段; pHsa-m122经Invitrogen公司测序证实,miR-122的编码基因片段已经正确插入pSuper载体中。2.载体的生物活性鉴定:荧光、流式、Western blot的结果均表明:pHsa-m122与报告质粒GFP-122si共同转染人肝癌细胞系HepG2,能够有效抑制绿色荧光蛋白的表达。因此证实pHsa-m122可转录出具有生物活性的成熟的miR-122; 3.载体的初步应用:将pHsa-m122转染入人肝癌细胞系HepG2.2.15后,检测到细胞分泌上清中的HBsAg、HBeAg的表达量升高。结论1. miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上,miR-122的真核表达载体pHsa-m122克隆成功;2. pHsa-m122可以表达出具有生物活性的成熟的miR-122;3.在对miR-122与HBV复制关系的初步探索中,我们的实验结果提示miR-122可能与乙型肝炎病毒的复制有一定关系。miR-122真核表达载体pHsa-m122的成功构建,为进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用奠定了实验基础。本课题的创新点1.在国内首次通过检测报告质粒表达绿色荧光蛋白的量的方法来检测微小RNA真核表达载体的生物活性,并运用荧光、流式、Western blot的方法来鉴定出微小RNA真核表达载体的生物活性。2.在国内首次将微小RNA的真核表达载体运用到对乙型肝炎病毒复制的研究探索中。