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草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是最重要的草莓病毒之一,有关SVBV启动子的研究,国内至今尚无人涉及。启动子是转录、表达的最重要元件,CaMV 35S启动子是植物基因工程中最为常用的启动子,SVBV和CaMV同属于花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus),其启动子是否具有同样或更高的驱动活性尚不得而知。本研究克隆了中国SVBV全长启动子,进一步构建SVBV全长启动子植物表达载体,通过组织化学法和荧光光度法测定SVBV启动子的活性。初步鉴定SVBV全长启动子驱动活性已经超过CaMV 35S启动子。本研究将为植物基因工程提供一种新型的植物病毒强启动子,具有广阔的实际应用前景。1. SVBV启动子的克隆及序列分析用CTAB法从感染SVBV的草莓叶片中提取总DNA,设计特异性引物扩增SVBV启动子序列,克隆并测序,SVBV启动子序列(SVBV-P1)全长1017 bp。将其与美国SVBV启动子序列(SVBV-NC001725)以及花椰菜花叶病毒属其它成员的启动子序列相比较,结果表明SVBV-P1与SVBV-NC001725相似性最高,达78.7%,而与花椰菜花叶病毒属其它成员的启动子序列相似性均较低,仅为15.1%～25.3%。构建启动子序列系统关系树,结果显示SVBV-P1与SVBV-NC001725单独形成一个亚分支,说明来源于草莓的2个SVBV亲缘关系最近,而与其同属其它成员的亲缘关系相对较远。利用PlantCARE软件对SVBV全长启动子的核苷酸序列进行结构分析,发现SVBV全长启动子和大多数真核启动子一样都存在着一些保守基序,如在翻译起始位点上游-40 bp存在一个典型的TATA-box(TTTTA),还在上游的多个位点发现了CAAT-box,此外,在该序列中还发现一些潜在的植物调节因子,如GA-motif(AAGATGA)、as-2-box(GAAATGATG)等。2. SVBV启动子植物表达载体的构建植物表达载体pINT121本身带有gus报告基因,将本研究克隆的SVBV全长启动子和美国SVBV启动子分别与pINT121 gus基因前的35S启动子置换。在启动子序列两端引入酶切位点,获得SVBV全长启动子阳性克隆pGEM-P1和美国SVBV启动子阳性克隆pGEM-P2。提取质粒双酶切,将2个启动子片段分别与同样双酶切回收的pINT121大片段连接,转化并筛选出阳性克隆,构建的植物表达载体命名为pINT P1和pINT P2。3.表达载体以根癌土壤杆菌介导进行瞬时表达利用三亲交配法将表达载体pINT P1、pINT P2和pINT121导入根癌土壤杆菌,将含有各启动子表达载体的根癌土壤杆菌菌液注射入本氏烟茎部,利用组织化学染色进行启动子活性的定性鉴定;再用根癌土壤杆菌菌液浸润本氏烟叶片,利用gus荧光光度测定法进行启动子活性的定量分析,观察不同启动子活性强弱。4. gus活性的组织化学检测和荧光活性分析利用组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性,组织化学染色结果表明,在pINT P1、pINT P2、pINT121表达的植株茎部的维管组织和部分皮层细胞均能观察到蓝色位点,说明各启动子都能驱动gus基因在植物细胞中表达。从各切片的gus染色强度上来看, pINT P1的启动子驱动gus基因的表达水平要高于阳性对照pINT121的35S启动子。荧光光度法测定结果表明,pINT P1的平均相对gus活性高于pINT P2和pINT121,pINT P1的gus活性是pINT121的138.6%,而pINT P2仅是pINT121 gus活性的87.9%。作为空白对照的非转基因烟草植株几乎无gus表达活性。5.表达载体以根癌土壤杆菌介导转化烟草利用叶盘法将含有表达载体pINT P1、pINT P2和pINT121的根癌土壤杆菌分别转化普通烟(云烟85),经系列抗性筛选获得抗性再生烟株,PCR检测证明已将gus基因转入烟草。