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杆状病毒是一类双链环状DNA病毒,作为生物防治杀虫剂及高效外源蛋白表达载体得到了广泛研究,其分子生物学和侵染机制的研究也取得了很大进展。杆状病毒基础理论的研究不仅有助于对病毒自身的了解,而且为更好的利用杆状病毒提供了可能。杆状病毒的基因中含有很多非必需基因,其中杆状病毒的组织蛋白酶基因(v-cath,viral cathepsin)就是杆状病毒病毒复制的一类晚期非必需基因。 V-cath基因,又称半胱氨酸蛋白酶基因cp,自1992年Rawling在AcMNPV中发现此基因以来,人们对v-cath基因的结构及其蛋白已有了较为深入的研究,对v-cath的功能有了初步的探讨。 昆虫被杆状病毒感染后会发生液化现象,这有利于病毒向周围环境中扩散。缺失v-cath的AcMNPV病毒感染昆虫后,不能导致宿主的液化,显示v-cath与宿主的液化即组织的降解有着直接的联系。V-CATH蛋白能够特异性地降解细胞的肌动蛋白,这可能直接导致了细胞骨架的崩溃和宿主昆虫的液化死亡。 HaSNPV是从自然界发病的棉铃虫中分离得到的单核衣壳核多角体病毒,HaSNPV的v-cath基因的编码区长1098bp,预计编码一个366个氨基酸的蛋白产物。HaSNPV的V-CATH蛋白与其他杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构并保留有相同的酶活性位点,根据已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建了v-cath基因的进化树,发现HaSNPV的v-cath位于NPV组中一个单独的分支,结合v-cath基因在棉铃虫病毒基因组中的位置与其他NPV有较大不同,推测HaSNPV的v-cath基因可能拥有特殊的进化历程。本文通过构建缺失v-cath基因的HaSNPV重组病毒,为研究HaSNPV的v-cath的功能奠定了基础。 我们在HaSNPV的v-cath基因序列的上游和下游分别取一段约为600bp左右的DNA片段作为上游同源交换臂和下游同源交换臂,设计引物,PCR扩增,将这两个DNA片段分别克隆到质粒pBluescript KS-上,然后将带有hsp70真核启动子的报告基因LacZ基因(β-半乳糖苷酶基因)片段插入到pBluescript KS-的上游交换臂和下游交换臂之间,得到转移载体。将转移载体和野生型HaSNPV DNA共转染Hz细胞,通过空斑纯化实验筛选得到重组病毒。PCR鉴定重组病毒。用所得到的重组病毒感染虫体,发现虫体不液化。表明HaSNPV的v-cath基因与虫体的液化有着直接的联系。