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研究背景冠状动脉粥样硬化是一种伴随多种严重并发症与后果的慢性炎症性反应,是影响全球死亡率与残疾率的重要原因。氧化应激损伤产生活性氧物质,从而造成的内皮细胞损伤被普遍认为是冠状动脉粥样硬化发生的起始因素。细胞自噬是一种真核细胞依赖溶酶体分解代谢受损细胞器及错误蛋白的生命过程,可通过抑制炎症通路,减少细胞凋亡与坏死,抑制内质网应激等方式逆转氧化应激反应带来的不良后果。以自噬溶酶体的形成为界限,分为早期自噬与终末期自噬。尽管,近年来在氧化应激反应中细胞自噬被广泛研究,但其发挥的保护作用仍存在争议,尤其是对于终末期自噬研究尚少。细胞焦亡作为一种新型程序性细胞死亡方式与心血管系统疾病密切相关。研究发现,抑制终末期自噬后,自噬溶酶体无法正常行使功能,细胞内自噬小体与相关蛋白累积,直接导致难以降解的NLRP3炎症小体增加与聚集,最终加重细胞炎症反应。由此,在氧化应激反应介导的冠状动脉粥样硬化疾病中,内皮细胞终末期自噬是否对细胞焦亡产生影响仍需要进一步的研究。MicroRNAs是由20-40个核苷酸组成的,具有高度保守序列的单链非编码RNA,调控众多生命过程的基因表达。其中,microRNA-103（miR-103）属于位于人类5号染色体上的MIR-103/107家族,广泛表达于各个组织中。大量研究表明,miR-103对心血管系统的多种疾病具有调控作用。其中近期提出,抑制miR-103表达可通过阻碍自噬小体与溶酶体的融合,从而阻断终末期细胞自噬发生。综上,本实验将在人冠状动脉内皮细胞氧化应激损伤条件下,研究miR-103是否能够通过终末期自噬调控细胞焦亡。研究目的本实验通过人冠状动脉内皮细胞氧化应激模型,研究终末期自噬是否对内皮细胞焦亡产生影响。明确miR-103在H2O2刺激下的变化趋势及作用,探讨miR-103与BNIP3之间的关系,及miR-103是否通过BNIP3对终末期自噬与细胞焦亡产生影响。研究方法1.HCAECs细胞进行H2O2时间梯度刺激培养,构建冠状动脉内皮氧化应激模型。使用MTS活性检测试剂盒检测内皮细胞生存率,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平评估在不同时间点H2O2的刺激下内皮细胞的损伤程度,同时使用Western bolt技术检测细胞中自噬相关蛋白P62,LC3,p-mTOR/mTOR的表达,及细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Caspase1,IL-1β的表达,观察细胞自噬及焦亡信号通路的变化。2.应用自噬抑制剂3MA、bafA1抑制细胞自噬的发生,MTS再次检测细胞活性,DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量。使用Western blot检测使用bafA1后细胞自噬与焦亡蛋白的表达,免疫荧光染色观察LC3B与P62的聚集情况,同时使用透射电子显微镜观察细胞内自噬体,研究细胞终末期自噬在H2O2介导的氧化应激损伤过程中发挥的作用。3.使用实时定量PCR检测不同时间点H2O2刺激下miR-103的表达。利用慢病毒转染构建miR-103高表达,低表达及NC阴性对照模型。检测转染后细胞活性,明确miR-103在氧化应激损伤中发挥的作用。Western blot检测自噬与焦亡相关蛋白的表达,免疫荧光染色观察LC3B的聚集及使用透射电子显微镜观察细胞内自噬小体的产生,进一步研究miR-103对细胞自噬的调控作用。4.利用Western blot检测氧化应激模型及加入细胞终末期自噬抑制剂bafA1后BNIP3的表达变化。并在高、低表达miR-103模型中,研究miR-103对BNIP3的调控作用。使用siBNIP3分别在NC与低表达miR-103模型内沉默BNIP3,同时加入H2O2刺激后,检测细胞活性,观察BNIP3在氧化应激模型中对内皮细胞发挥的作用。使用Western blot检测siBNIP3细胞内自噬与焦亡相关蛋白的表达水平,研究BNIP3对细胞自噬及焦亡的影响。研究结果1.在H2O2刺激下,HCAECs生存率降低,细胞内ROS水平升高,提示在H2O2刺激下内皮细胞产生损伤。通过Western blot检测发现,细胞内自噬相关蛋白LC3BⅡ/LC3BⅠ比值降低,P62表达水平与p-mTOR/mTOR比值升高,提示细胞自噬水平降低。同时,检测发现细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Casepase1、IL-1β表达水平增加,提示氧化应激反应促进细胞焦亡。2.加入早期自噬抑制剂3MA与终末期自噬抑制剂bafA1后,发现在氧化应激损伤中3MA对细胞损伤改变无意义,而加入bafA1则进一步加剧细胞死亡,提高ROS水平。随后检测加入bafA1的细胞中自噬与焦亡的变化发现,抑制终末自噬,可增加P62与LC3BⅡ在细胞内的累积,减少mTOR磷酸化水平,最终加剧细胞内炎症性死亡的发生。3.H2O2刺激下,miR-103表达呈时间依赖性降低。构建miR-103高低表达模型后,发现高表达miR-103提高细胞生存率,抑制细胞内自噬小体的累积,减少细胞焦亡蛋白表达,而该过程可被bafA1所阻断。相反,低表达miR-103则通过增加细胞内自噬小体的累积,加剧细胞焦亡的发生,最终加剧了对细胞的损伤。4.H2O2及bafA1刺激下,BNIP3蛋白表达水平明显增加,而沉默BNIP3则通过减少细胞内LC3BⅡ、P62等自噬相关蛋白表达,抑制细胞焦亡,从而减少内皮细胞的损伤。同样的,抑制低表达miR-103细胞中BNIP3水平,可抵消低表达miR-103对细胞终末期自噬与焦亡的影响,最终发挥了对内皮细胞的保护作用。结论在H2O2介导的HCAECs急性氧化应激损伤模型中miR-103表达降低,内皮细胞中降低的miR-103无法发挥对BNIP3蛋白的靶向抑制作用,影响内皮细胞终末期自噬,使自噬相关蛋白LC3BⅡ与P62在细胞内累积,mTOR活化受抑制,进而增加了细胞焦亡水平,最终加剧了细胞的损伤。相反,在急性氧化应激损伤过程中,增加miR-103表达可通过靶向抑制BNIP3,减少对于终末期自噬的抑制,从而降低细胞炎性死亡,最终发挥了细胞保护作用。创新点及研究意义本研究明确了在内皮细胞急性氧化应激反应中,细胞终末期自噬对焦亡通路产生影响。发现miR-103在内皮氧化应激损伤条件下对终末期自噬与焦亡发挥调控作用。同时,深入研究miR-103通过靶向抑制下游基因BNIP3影响终末期自噬及焦亡。本研究为心血管系统中的冠状动脉粥样硬化疾病治疗提供了新的研究方向,为miR-103的作用机制提供了新的理论支持。