论文部分内容阅读
目的:纳米二氧化硅(nano silica,NS)粉尘是大气中细颗粒物的重要组成成分,是引发雾霾天气污染的重要因素之一,对人类健康存在不可忽略的潜在威胁,尤其是对呼吸系统肺部损伤,其发病机制可能与肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophages,AM)在识别和吞噬随呼吸进入肺部的NS粉尘而引起的细胞凋亡相关,而PI3K/AKt/mTOR信号通路也被认为是细胞凋亡事件的重要参与者。因此,本课题以大鼠AM细胞和NS粉尘为研究对象,分析NS粉尘染毒后AM细胞的凋亡情况;通过PI3K抑制剂LY294002、AKt抑制剂AZD5363和mTOR抑制剂Rapamycin作用AM细胞,探讨PI3K/AKt/mTOR信号通路作用方式;同时分析抑制剂LY294002对AM细胞凋亡率、线粒体膜电位及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平的影响,探讨PI3K/AKt/mTOR信号通路在NS粉尘诱导AM细胞凋亡进程中的潜在调控机制,为NS粉尘相关性肺部疾病的预防和治疗探寻新的作用靶点。方法:(1)以F12K基础培养基配制不同浓度的NS粉尘悬液(0、5、10、20、40、60、80、100μg/mL)染毒生长状态良好且处于指数期的AM细胞经12h、24h和48h培养后,CCK-8检测细胞存活率,筛选后续实验所需的NS粉尘染毒AM细胞最佳染毒浓度和作用时间,建立AM细胞染尘模型。(2)NS粉尘体外染毒AM细胞24h后,用Hoechst 33342蓝色荧光染料避光染色细胞10min,倒置相差荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。(3)NS粉尘体外染毒AM细胞24h后,采用Annexin V-FITC/PI双染法及JC-1标记荧光染色法联合流式细胞术分别检测空白对照组和NS粉尘组AM细胞的凋亡率及线粒体膜电位;免疫印迹法(Western blot,WB)检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平,探讨NS粉尘对AM细胞的凋亡影响。(4)分别用PI3K抑制剂LY294002、AKt抑制剂AZD5363、mTOR抑制剂Rapamycin在NS粉尘染毒前预处理AM细胞2h,利用Western Blot法检测抑制剂作用前后PI3K/AKt/mTOR信号通路蛋白PI3K、AKt、mTOR、p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达的影响,探讨PI3K/AKt/mTOR信号通路分子调控机制及表达方式。(5)LY294002抑制剂预处理AM后,用Annexin V-FITC/PI双染法、JC-1标记荧光染色法及Western blot法检测抑制剂对细胞凋亡率、线粒体膜电位下降程度、凋亡蛋白Bax、Bcl-2和通路蛋白PI3K、AKt、mTOR、p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达水平的影响,验证PI3K/AKt/mTOR信号通路与NS粉尘诱导AM凋亡过程的相关性。结果:(1)NS粉尘对AM细胞的存活率有一定的抑制作用,其抑制率与NS粉尘浓度及作用时间正相关。AM细胞存活率随NS粉尘浓度增加显著下降;NS粉尘染毒细胞存活率随染毒时间延长而降低,各染毒时间组间细胞存活率具有显著性差异(除80μg/mL NS粉尘浓度)。实验选取终浓度为5μg/mL和10μg/mL NS粉尘悬液染毒AM细胞24h进行后续实验。(2)NS粉尘诱导AM细胞凋亡形态学改变。5、10μg/mL NS粉尘染毒组在倒置相差荧光显微镜下可见亮蓝色强荧光染色细胞,该细胞形态欠规则、体积相对较小,细胞核呈波纹状、折叠样或分叶状等改变,细胞染色质呈凝集浓染状态且染色亮度强于细胞质及周围细胞,可见部分核固缩、核碎裂的典型凋亡小体。(3)AM细胞凋亡率、线粒体膜电位下降程度及凋亡促进蛋白Bax表达随NS粉尘浓度增加而增加,凋亡抑制蛋白Bcl-2相对表达量随NS粉尘浓度增加降低。(4)AM细胞无NS粉尘处理的情况下,PI3K、AKt、mTOR、p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白均有表达;5μg/mL NS粉尘与AM共同作用24h后,PI3K、AKt、mTOR表达量无明显变化,而p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达明显下调,PI3K/AKt/mTOR信号通路处于抑制状态;分别采用抑制剂LY294002、AZD5363和Rapamycin抑制AM细胞PI3K/AKt/mTOR信号通路后,发现各组中p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白下降趋势不同,PI3K/AKt/mTOR信号通路可能是从PI3K向AKt,AKt向mTOR的顺序依次逐级调控。(5)特异性抑制剂LY294002下调PI3K/Akt/mTOR信号通路,对比未用抑制剂组,AM细胞线粒体膜电位降低程度和细胞凋亡率显著增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达上升,Bax/Bcl-2比值显著增加;同时p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白表达显著降低。结论:(1)NS粉尘可诱导大鼠肺泡巨噬细胞凋亡的发生,Hoechst33342染色可见NS粉尘染毒的AM细胞出现明显的核固缩、核碎裂、强亮蓝色荧光染色等细胞凋亡形态。(2)短期暴露NS粉尘可有效的抑制AM细胞的PI3K/AKt/mTOR信号通路,并随着NS粉尘浓度的增加,促凋亡蛋白Bax表达上升,抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降,AM细胞凋亡率增强。(3)PI3K/AKt/mTOR信号通路可能从PI3K向AKt,AKt向mTOR的顺序依次逐级调控,抑制剂LY294002作用PI3K可以逐级影响PI3K/AKt/mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化表达水平,对研究PI3K/AKt/mTOR信号通路的调节机制更具代表性。(4)抑制剂LY294002有效抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路蛋白表达后,NS粉尘染毒AM细胞明显降低线粒体膜电位,增强Bax上调和Bcl-2下调表达,进一步促进NS粉尘染毒AM细胞凋亡的发生。