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1954年,第一例人类同种肾移植手术在美国完成,开启了人类医学的新时代,这项研究的开创者约瑟夫·默里也获得了1990年诺贝尔医学与生理学奖。随着现代医学的不断进步,器官移植的存活率大幅提高,接受手术的人数也大幅增长。人类同种异体器官移植已经拯救了成千上万器官衰竭患者的生命,被誉为"21世纪医学之巅”。然而,随着器官移植需求数量的增长,器官短缺的问题也日益凸显,已经成为制约临床器官移植发展的主要瓶颈。异种移植可以缓解器官不足的现状,猪由于在解剖学、生理学等方面与人类的相似性,成为科学界公认的异种器官移植最合适的异种器官来源。然而,猪器官应用于临床实验面临着诸多难题,其中最为关键的障碍是超急性排斥反应(Hyperacute Rejection,HAR)。HAR主要是由a1,3-半乳糖基转移酶(al,3-galactosyltransferase, GGTA1)基因编码的形成的aGal表位引起,通过敲除GGTA1基因可以消除aGal表位从而克服HAR,自从2003年以来,国外已有报道缺失GGTA1基因的猪器官已经用于异种器官移植实验并成功克服了HAR。然而,国内这方面的研究起步较晚,尚未见有GGTA1基因敲除克隆猪出生的报道。五指山近交系小型猪是我国培育的高度近交群体。其基因高度纯合,便于基因工程操作；血液生理生化指标与人类接近,器官大小近似人类,是更为理想的异种器官移植供体。本研究构建了以新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,neo)为筛选标记基因的启动子缺陷型打靶载体,neo基因上游加入Kozak序列以增加翻译效率。打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选。用PCR法检测药物抗性的细胞克隆点。转染筛选共得到499个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组。以其中1个GGTA1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,一头受体怀孕,分娩获得2头克隆猪,分别编号为WZSP-KO01和WZSP-KO02,经过PCR和Southern鉴定均为GGTA1单等位基因敲除克隆猪。本研究培育GGTA1基因敲除的五指山小型猪,为异种器官移植研究提供基础平台。研究内容主要分为以下三个部分：第一部分：启动子缺陷型打靶载体pBS-GGTAl-SKO的构建根据NCBI数据库的GGTA1基因序列设计引物,LAF/LAR和SAF/SAR分别扩增5684bp的同源长臂,1692bp的同源短臂。以近交系五指山小型猪基因组为模版,PCR扩增得到5684bp的同源长臂(Long Arm,LA),1692bp的同源短臂(Short Arm,SA),将LA和SA分别克隆到T载体pEASY-T1 Simple上,测序正确后得到重组载体pEASY-T1-LA, pEASY-T1-SA。打靶骨架载体pBluescriptⅡSK(+)和pEASY-T1-SA分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切、凝胶电泳回收载体骨架PBS和SA片段,用T4 DNA连接酶连接,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后得到载体PBS-SA。载体PBS-SA和pIRESneo分别用SmaⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶电泳回收PBS-SA和neo片段,用T4DNA连接酶连接,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后得到载体PBS-SA-neo。载体PBSSA-neo和pEASY-T1-LA分别用NotⅠ和ClaⅠ双酶切、凝胶电泳回收PBS-SA-neo和LA片段,用T4 DNA连接酶连接,转化后筛选重组子、提取质粒后经酶切鉴定后获得五指山小型猪GGTA1基因敲除载体pBS-GGTA1-SKO。打靶载体pBS-GGTA1-SKO全长约12Kb,包括5684bp同源长臂LA和1692bp同源短臂SA, pBS-GGTA1-SKO质粒经不同的限制性内切酶酶切后获得相应的正确的大小不等的片段。第二部分：五指山小型猪胎儿成纤维细胞的转染筛选与鉴定利用限制性内切酶ClaⅠ酶切质粒pBS-GGTA1-SKO,使之线性化。细胞采用Amaxa NucleofectorⅡ核转染仪及配套转染试剂进行转染。转染前将细胞接种至六孔板中,待细胞长至80-90%汇合时,利用电转染法将线性化的打靶载体pBS-GGTA1-SKO按照NucleofectorⅡ核转染仪程序T016转染至五指山猪胎儿成纤维细胞,24h后加入G418(250μg/mL)筛选10-15 d,然后将具有抗性的细胞克隆传至24孔板中进行扩增,每孔细胞按1：2传至另一24孔板中,取其中1孔细胞用于PCR鉴定,另1孔细胞冻存备用。提取抗性细胞克隆点DNA进行PCR鉴定,对阳性细胞克隆同源重组区进行测序验证。打靶载体共转染细胞1.5×107个,经过筛选获得G418抗性细胞克隆499个,为了验证细胞克隆点是否发生了同源重组,根据同源重组的位点,利用2对引物分别对这些克隆点进行了两轮PCR检测,PCR鉴定所用引物为P1F/P1R和P2F/P2R,结果有2个克隆点可以扩增出了大小正确的PCR产物,分别为1890bp和5895bp,命名为G12和G13。对这2个阳性克隆点进行DNA测序,测序结果证实细胞发生了正确的同源重组。第三部分：核移植与胚胎移植及克隆猪的鉴定以GGTA1+/-细胞为供体细胞,采用显微操作盲吸法去核和电融合法进行核移植,克隆胚胎体外培养1-2天,将1-2细胞阶段的重构胚移植到2头受体猪中,移植方法为手术法输卵管深部移植,每头移植200枚左右胚胎。将1-2细胞阶段的重构胚移植到2头受体母猪中,30天B超检测,1头受体母猪妊娠,妊娠率为50%。代孕母猪分娩共产仔2头,分别编号为WZSP-KO01和WZSP-KO02。提取克隆猪组织基因组DNA,以基因组DNA为模板,通过PCR方法获得地高辛标记探针。用NcoⅠ酶切基因组DNA 12h以上(20μg),在0.8%琼脂糖凝胶上电泳过夜,凝胶中的DNA转移至尼龙膜上固定后进行杂交。经过PCR和southern鉴定2头克隆猪均为GGTA1单等位基因敲除猪,PCR鉴定所用引物为P1F/P1R和P2F/P2R,均扩增出了大小正确的PCR产物,分别为1890bp和5895bp。Southern鉴定阳性克隆猪出现两条杂交带：GGTA1单基因敲除的克隆猪Southern杂交出现两条带,野生型GGTA1基因在8kb处,同源重组型的GGTA1基因出现在5.4kb处,两条带亮度比例为1：1。而未发生同源重组的GGTA1基因仅有一条8 kb杂交带,证实这两头克隆猪均为GGTA1单等位基因敲除克隆猪。总之,本研究成功构建了五指山小型猪GGTA1基因部分exon4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,转染后筛选得到了2个单等位基因敲除的阳性细胞克隆点,核移植和胚胎移植获得了2头GGTA1单等位基因敲除的五指山小型猪,建立了异种器官移植研究的基础平台,为培育适于人类器官移植的GGTA1双等位基因敲除克隆猪提供了基础研究平台。