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金荞麦[Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara]是原产于我国的一种蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill.)多年生草本植物。因其根状茎中活性物质(主要为类黄酮次生代谢产物)所具有的抗肿瘤、抗炎等多种药效学功能,而成为了多种重要的预癌、抗癌药物的主要成分。近年来备受关注的同时也使得金荞麦野生资源遭到了极大的破坏而濒临灭绝,被国家列为二级保护植物,这就使野生金荞麦生物活性物的工厂化生产显得十分迫切。多年来,国内外关于金荞麦资源收集、多样性、生理特性、育种、药效学以及生态环境等方面的研究已有大量报道,但基于与活性成分合成相关的功能基因的分子生物学和基因工程方面的研究,国内外还鲜有报道。本研究旨在通过对金荞麦类黄酮生物合成途径中重要基因(FdLAR、FdDFR、FdCHS、 FdMYBP1)的克隆和功能的初步分析,阐明金荞麦类黄酮生物合成途径的分子调控机制,为下一步利用基因工程手段,通过调控野生金荞麦次生代谢产物合成途径而实现药用活性物质的工厂化生产提供理论依据,主要结果如下：(1)金荞麦无色花色素还原酶基因(FdLAR)的克隆及功能初步分析采用简并PCR结合RACE技术,从金荞麦中分离得到了一个无色花色素还原酶LAR(leucoanthcyanidin4-reductase,LAR)基因FdLAR的全长cDNA序列(GenBank accession: JN793953).序列分析表明,FdLAR基因cDNA全长1158bp,含有1个1176bp的最大开放阅读框,无内含子,编码一个长391个aa的蚩白质。同源比对和系统进化分析表明FdLAR基因的编码蛋白与其他已知物种中的LAR蛋白具有较高的同源性,其中与草莓(Fragaria chiloensis,ADP37950.1)的LAR蛋白相似性最高,为75%,而与大戟科的蓖麻(Ricinus communi)的LAR蛋白遗传距离最近。生物信息学分析结果显示金荞麦FdLAR蛋白具有植物LAR蛋白的保守结构域,在N端具有NADPH结合位点和底物特异结合位点,氨基酸序列中无信号肽,属于亲水性蛋白,可能定位于线粒体基质中,具有酶的典型三级结构特征。构建了FdLAR和F’dDFR基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)中诱导表达重组蛋白,以FdDFR/FdLAR酶催化反应体系为整体,在NADPH存在的反应体系中,测定两种重组蛋白的酶活,结果显示FdDFR/FdLAR体外重组蛋白能够催化起始底物二氢槲皮素(Dihydroquercetin、DHQ)向下游终产物儿茶素[(+)catechin]转化,具有相应的生物酶活,且具有底物特异性。构建了FdLAR基因的植物超表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过分析转基因植株中目的基因表达水平与类黄酮积累之间的关系,对FdLAR基因的功能进行了初步验证。结果表明,通过GUS组织化学染色法、基因组DNA的PCR检测及荧光定量PCR检测,获得了阳性转基因烟草15株。15株转基因烟草叶片中类黄酮含量均有不同程度的提高,其中以T2株最为明显,是野生型的7倍。进一步检测转基因烟草中目的基因的表达发现,FdLAR基因的表达水平与其类黄酮含量成正相关关系,说明克隆得到的FdLAR基因是金荞麦类黄酮合成途径后期的一个关键基因。(2)金荞麦查尔酮合成酶基因(FdCHS)的克隆与功能初步分析根据已在NCBI登录的金荞麦查尔酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)基因FdCHS的核苷酸序列,克隆其编码框全长并构建原核表达载体和植物超表达载体。在大肠杆菌Transetta(DE3)中诱导表达重组蛋白,以香豆酰-CoA (4-Coumaroyl-CoA)和丙二酰CoA (Malonyl-CoA)作为底物,测定其酶活,结果显示获得的重组蛋白具有正常的生物酶活,能够将其特异底物转化为下游产物。利用农杆菌介导的叶盘法获得转基因烟草,通过分析转基因植株中目的基因的表达水平与类黄酮积累之间的关系,对FdCHS基因的功能进行了初步验证。结果表明,获得的11株转基因烟草中,有10株叶片中类黄酮含量有不同程度的提高,其中以T3株最为明显,是野生型的3.4倍。而T10株类黄酮含量没有显著提高,进一步检测转基因烟草中目的基因的表达发现,FdCHS基因的表达水平与其类黄酮含量总体上成正相关关系,而T10株中没有检测到目的基因的表达,可能是发生了同源基因的共抑制现象。说明FdCHS基因是金荞麦类黄酮合成途径中的一个关键基因,其表达水平直接影响植株中类黄酮类物质的积累。(3)金荞麦类黄酮的生物合成与金荞麦FdCHS, FdDFR、FdLAR及FdMYBPl基因的表达特征分析研究了金荞麦在不同发育时期各个组织中类黄酮含量和相应组织中与类黄酮生物合成相关的3个重要结构基因FdCHS、FdDFR、FdLAR和1个转录调控因子MYBPl的表达水平之间的关系。结果表明金荞麦不同组织中的类黄酮含量在不同发育时期,呈现出不同的变化规律,在幼苗的营养生长阶段,不同组织中类黄酮含量总体情况是叶>根>茎,在生殖生长阶段的总体变化规律为根状茎>花>叶>茎。3个结构基因在金荞麦不同生育期的表达变化趋势却基本保持一致,都呈现出“两头高,中间低”的表达模式。根据4个基因在茎段中高表达和根状茎中的低表达,对应其茎段中的低类黄酮含量和根状茎中的高类黄酮含量结果推测：金荞麦类黄酮合成和积累的部位存在差异,茎段可能是类黄酮合成的重要部位,但是类黄酮并不同在茎段中持续的大量积累,而是转移至根状茎积累。进一步对生殖生长期不同组织中与类黄酮合成紧密相关的DFR/LAR酶活进行测定,发现茎段中的酶活均高于其他组织,说明其中发生着大量与类黄酮合成相关的酶催化反应,进一步证明了金荞麦类黄酮合成和积累的组织特异性,其类黄酮合成的主要部位是茎段,并向下运输至根状茎大量积累。