目的：　　人免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus，HIV-1)感染靶细胞除需要结合靶细胞上的CD4分子，还需要辅助受体的参与。CCR5和CXCR4是HIV-1最常利用的辅助受体。　　国外的研究认为HIV-1在感染早期的无症状阶段主要利用CCR5辅助受体。但在急性感染者中，CXCR4和CXCR4/CCR5双嗜性毒株也存在，有报道其存在频率大约为3.17-17.2％。而且，HIV-1对辅助受体的利用和转化与病毒基因亚型的有关，不同亚型HIV-1感染的不同阶段对CXCR4的利用的频率存在明显差异。　　病毒利用CXCR4辅助受体不仅与疾病进程加速和进入AIDS期有关，也预示着对HAART治疗的反应较差。因此，检测辅助受体的类型对临床预测疾病进展和制定用药方案都是极其重要的。特别是随着CCR5拮抗剂Maraviroc逐渐应用于临床早期抗病毒治疗，辅助受体的检测更显得具有重要的临床应用价值，同时也对CXCR4劣势病毒株的检出敏感性提出了更高的要求。　　表型法和基因型法是检测HIV-1辅助受体常用的方法。表型法是检测病毒嗜性的金标准，以Trofile为代表，其对CXCR4劣势株的检出敏感性较高(0.3-10％)。基因型法是根据gp120的V3区基因编码的氨基酸序列，并结合生物信息学预测工具来推测辅助受体的利用情况。两者相比，基因型法以经济方便快捷等优点被欧洲指南所推荐，但由于对CXCR4毒株预测的敏感度不高(50-70％)，而导致基因型预测的结果与表型检测的结果不完全一致。提高基因型与表型的一致性的手段之一是联合应用各种生物信息学预测工具，另外则是通过改善实验技术提高对CXCR4劣势株的检出敏感性。　　近年，深度测序以操作简便、测序快速等优势，越来越多的应用在基因型辅助受体的预测中。有研究显示，利用深度测序技术结合辅助受体预测工具（如geno2pheno和PSSM）与表型嗜性检测法有很好的一致性，且可对劣势病毒株定量，更好的反应病毒准种的构成情况。　　我国HIV-1流行株与国外不同，经性传播感染者以CRF01_AE亚型为主，近年我国经男男性行为感染HIV-1的病例也不断增长。前瞻性队列研究显示该人群疾病进展明显快于其他人群，该人群疾病进展快是否与毒株利用CXCR4辅助受体有关还需要深入研究，而针对该人群早期抗病毒治疗的用药选择也是迫在眉睫的问题。　　本研究对62例经男男性接触感染HIV-1的急性感染者血浆病毒进行动态研究，采用深度测序的方法检测病毒envelop基因V3区序列，采用多规则联合应用的方法预测病毒辅助受体类型，提高CXCR4劣势毒株的检测敏感性，评估该人群最初感染病毒中CXCR4株所占比例，以及随访1年、2年后辅助受体转化的情况，为该人群早期抗病毒治疗以及预测疾病进展提供数据支持。　　方法：　　1、研究对象　　我国东北地区MSM HIV-1急性感染者62例，满足以下任何之一或多项:(1)3个月内血清HIV抗体阳转者;(2) HIV抗体阴性但HIV RNA阳性者;(3) HIV抗体弱阳性但在两周之内可以重复并OD值较前次升高者;(4) HIV抗原阳性和/或WB抗体检测少于4条蛋白带者。基线点62例，完成1年随访的31例，完成2年随访的22例。所有病例研究时均未接受抗病毒治疗。　　2、HIV-1基因组RNA的提取　　21000g，4℃离心1小时，弃掉上清血浆，留管底140μ L血浆。按照QIAampViral RNA Mini Kit操作规程提取血浆病毒基因组RNA。　　3、特异性逆转录　　使用特异性下游引物(5-TCTTGCCTGGAGCTGTTTGATGCCCCAGAC-3，HXB2:7478-7507)，按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)试剂盒操作要求进行逆转录。每个样本平行做3份实验。　　4、含V3区目标片段的扩增　　按照KOD plus(TOYOBO，Japan)高保真酶试剂盒说明书反应物终浓度要求，配成总体积为20μ l的反应体系，进行两轮巢氏PCR扩增目标基因，第一轮引物对:(5-TCAGTACAATGYACACATGG-3,HXB2:6500-6519),(5-GTCYGAGTCACTTCTCCAATT-3，HXB2:7202-7222);第二轮引物对:(5-TGTAAAACGACGGCCAGTYTGTTAAATGGYAGYYTAGC-3,HXB2:6548-6567),(5-CAGGAAACAGCTATGACCTTACAGTAGAAAAATTCCCCT-3,HXB2:6906-6927)。每个样本平行做3份实验。　　5、深度测序及序列分析　　PCR产物纯化及定量;进行文库制备、emPCR扩增;双向测序;运行454GS-JrShotgun Data Processing pipeline程序去掉序列两端接头，输出FastA格式文件。将每个样本所测的reads与该样本SGA法参考序列做CLUSTAL W比对，应用GSAmplicon Variant Analyzer(AVA)软件修正同聚区碱基的插入或缺失，保证翻译阅读框的完整性。并进行序列清理，满足以下任何之一者删除该reads:(1)未完全覆盖V3区;(2) reads中含终止密码子;(3) reads长度小于主峰长度50bp以上。　　6、深度测序错误率评估及劣势株的检出敏感性　　将10个质粒平行做sanger测序和深度测序，以sanger测序的结果作为参考，深度测序中任何与sanger测序不一致的碱基即为深度测序的错误。计算10个质粒的平均错误率，以5倍的平均错误率作为劣势株检出敏感性的阈值。　　7、辅助受体预测　　分别采用Geno2pheno[coreceptor]假阳性率(FPR)设为5.75％、WebPSSM基于B亚型的PSSMx4R5和PSSMsinsi、Wetcat的SVM及11/25charge rule五种不同的预测工具预测病毒株的辅助受体。其中4种以上预测为CXCR4的判定为CXCR4毒株，达不到上述标准的均判定为CCR5毒株。　　8、统计学分析　　应用SPSS17.0进行统计分析，所有数据用中位数(IQR)表示;用Kaplan-Meier曲线表示从估计感染时间到发生不同结局事件的估计中位生存时间，log-rank检验比较利用两种不同辅助受体组的差异，P＜0.05有统计学意义。　　结果：　　1、研究对象基本资料　　基线点62例（平均感染时间33天），CRF01_AE占80.6％(50/62);完成1年随访的31例（平均感染时间361天），CRF01_ AE占87.1％(27/31);完成2年随访的22例（平均感染时间725天）CRF01_AE占86.4％(19/22)。　　2、深度测序数据质量的评估及劣势CXCR4的检出敏感性　　共115份血浆样本，成功扩增114例。　　深度测序114例样本及10个质粒的PCR产物，共得到42394条reads，主峰长度350bp/reads，总通量15Mb。　　114例样本得到40464条reads。完成同聚区碱基校正及reads清理后，剩余38688条reads，平均每个样本339条reads。　　10个质粒的平均错误率为0.168％，CXCR4劣势株的检出敏感性为1％。　　3、MSM急性感染者中基线辅助受体基因型构成　　基线时，含CXCR4劣势病毒株的感染者只有2例，全部为CRF01_ AE（全长分型）。占全部基线感染者的3.28％，占基线时CRF01_ AE亚型感染者的4.08％。　　4、MSM急性感染者随访1年、2年病毒的辅助受体基因型转换　　随访1年，3例(3/30)基线时CCR5毒株感染者转换为1年点携带CXCR4劣势株，这3例感染者全部为CRF01 AE（全长分型）。含CXCR4劣势病毒株感染者占全部1年点感染者的9.68％，占1年点CRF01 AE感染者的11.11％。　　随访2年，4例(4/21)基线时CCR5毒株感染者转换携带CXCR4劣势株，这4例感染者全部为CRF01_ AE（全长分型）。含CXCR4劣势病毒株感染者占全部2年点感染者的18.18％，占2年点CRF01 AE感染者的21.05％。　　5、辅助受体基因型与疾病进展的关系　　比较感染两种不同基因型辅助受体感染者疾病进展的差异，分别以病毒载量大于10000copies/ml和CD4+T下降到350cells/ul以下作为结局事件绘制生存曲线。Log-rank检验显示分别感染两种不同基因型辅助受体的感染者的疾病进展存在统计学差异趋势及显著性差异。　　结论：　　1、我国MSM HIV-1急性感染者传播毒株以利用CCR5辅助受体为主，在感染2年内，发生CXCR4辅助受体转换的比例很低。　　2、CXCR4毒株不是我国MSM HIV-1急性感染者疾病进展快的主要因素。　　3、我国MSM HIV-1急性感染者中仍存在少量的CXCR4毒株传播及辅助受体转换，尤其是开展早期抗病毒治疗前要加强检测，以指导临床合理用药。