不同Ca2+浓度养殖环境下三角帆蚌外套膜和内脏团组织CaM和CaLP基因的表达

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我国珍珠产量位居全球第一,但是珍珠质量不高,大型珍珠更是产量低下。为了解决珍珠质量低的问题,本实验室对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)的内脏团育珠进行了探索,研究发现内脏团空间大,更有利于大核珍珠培育。本实验采用三角帆蚌作为育珠蚌,从三角帆蚌的外套膜前中后部位、内脏团、性腺、淋巴组织中采集组织进行RNA提取,测得转录组数据。从三角帆蚌的转录组文库中挑选了与钙代谢相关的基因——钙调蛋白类似蛋白(Ca LP)基因。首先进行了转录组筛选基因的验证,实验证明了序列的真实有效,可直接做后续分析。分析发现,四个Ca LP基因中,Ca LP1基因可以编码152个氨基酸,具有4个EF-hand Ca2+结合域;Ca LP2基因编码163个氨基酸,同样具有4个EF-hand Ca2+结合域;Ca LP3基因编码150个氨基酸,具有3个EF-hand Ca2+结合域;Ca LP4基因编码163个氨基酸,具有4个EF-hand Ca2+结合域。其中Ca LP1、Ca LP3、Ca LP4与其他物种的同源性都在74%以上,具有高度保守的EF-hand区域。构建系统进化树表明,三角帆蚌四个基因与同属的合浦珠母贝和长牡蛎在进化树图上聚为一支,关系密切。为了探索钙调蛋白基因(Ca M)和Ca LP基因在淡水珍珠蚌中钙离子沉积中的功能,研究0、0.5、1.25、2、3 m M五个不同Ca2+浓度水环境下养殖三角帆蚌,并在插核后的0天、20天、50天、90天、120天对外套膜和内脏团组织采样,采用荧光定量方法检测组织Ca M基因和4个Ca LP基因表达量。结果表明:(1)Ca M基因:Ca M基因外套膜和内脏团组织在0 m M Ca2+浓度下始终处于过低表达水平;0.5 m M浓度下先降低后升高并维持稳定;1.25 m M浓度下在20天内脏团出现降低,之后升高至0天水平并保持稳定;在2 m M浓度下表达量在20天时显著上升达到各浓度中最高后保持高表达量状态;3m M浓度下在插核后20天表达量升高,之后时期表达量开始不断降低(P<0.05)。在插核后不同天数中,0天各浓度表达差异不明显;之后各天数的表达出现明显差异。相同条件养殖下,内脏团相比外套膜Ca M基因的表达量明显升高。研究发现,0.5 m M和2 m M Ca2+浓度会促进Ca M基因的表达,但0 m M和3 m M的浓度则会抑制Ca M基因的表达。(2)Ca LP1基因:在缺乏Ca2+的情况下,Ca LP1基因会由于钙的缺乏而降低,在2 m M和3 m M高浓度情况下会受到促进作用,表现出明显的上升趋势。并且在3 m M中并没有受到明显抑制作用。(3)Ca LP2基因:Ca LP2在低浓度和高浓度下都变现出降低的趋势。在插核的前期由于免疫但应会抑制Ca LP2基因的表达。外套膜中Ca LP2基因的表达量远远低于内脏团中的表达,外套膜多次出现未表达的情况。(4)Ca LP3基因:在插核0天,外套膜和内脏团相比,基因的表达量没有显著差异。插核后,低浓度下(0 m M、0.5 m M)内脏团表达量高于外套膜,而在高浓度下(2 m M、3 m M)内脏团表达量高于外套膜。外套膜在3 m M下表达出现稳定,而内脏团一直处于明显上升趋势。(5)Ca LP4基因:外套膜始终没有表现出明显的表达量变化。在内脏团中,在20天时,在低浓度下表现出高的表达量,而在高浓度下表达量受到抑制。高浓度下(2 m M、3 m M),20天之前没有明显变化,在50天及之后表达量开始升高,出现差异。为了研究不同钙离子浓度养殖环境下珍珠质沉积的情况,随机挑选了300只壳长8cm左右的蚌进行内脏团与外套膜有核珍珠插核手术,将经过手术插核后在不同Ca2+浓度环境下养殖180天,取样后对其珍珠直径和珍珠质沉积量进行分析。分析结果显示:珍珠直径测量和珍珠质沉积重量测量发现,2 m M Ca2+浓度比较适合珍珠珍珠沉积,浓度过高(3 m M)和过低(0 m M、0.5 m M)都会造成珍珠质沉积量下降。在珍珠质沉积的外观上观察发现,外套膜和内脏团沉积各有特点。外套膜沉积量少于内脏团,而且内脏团珍珠更加圆整,外套膜中则出现少数畸形珠。外套膜珍珠颜色红嫩,珍珠表面光滑;而内脏团珍珠表面沉积较粗糙且不平整。拉曼光谱分析仪实验分析结果表明,在类胡萝卜素成分引起的拉曼峰1131 cm-1、1527 cm-1处,内脏团的峰值小于外套膜。文石结晶参与的155 cm-1、706.5cm-1和1085.5cm-1处峰值内脏团也小于外套膜。
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