组蛋白赖氨酸特异性去甲基酶1(Lysine specific demethylase 1,LSD1)是一个黄素依赖的胺基氧化酶。它可以去除组蛋白H3的第4位、第9位赖氨酸的单、双甲基。LSD1在多种肿瘤组织中处于高表达状态,且在肿瘤的形成、增殖、转移侵袭和分化过程中发挥着重要作用。LSD1作为抗肿瘤药物研发的新靶点被广泛关注,因此,获取高效靶向LSD1的抑制剂或者诱导生物体内源性降解LSD1是治疗癌症的新途径。通过文献调研以及课题组的研究表明,以含氮杂环为骨架的杂环类化合物是一类重要的LSD1抑制剂。因此,探究靶向LSD1的含氮杂环化合物抗肿瘤活性具有重要意义。本论文首先利用原核系统表达LSD1,并利用亲和、凝胶和阴离子交换色谱对其进行纯化。然后,基于荧光的方法对三种不同结构类型的氮杂环化合物进行筛选,探讨了它们抑制LSD1活性的机理,并进一步评价它们的抗肿瘤活性。另外,我们也对类泛素修饰neddylation对LSD1稳定性的影响和修饰位点做了初步研究。本论文的具体研究内容包括以下几个方面:(1)芳肼类LSD1抑制剂的发现及抗肿瘤活性研究通过在杂环骨架[1,2,4]三氮唑[1,5-α]嘧啶上引入不同类型的取代基或官能团共设计合成了 31个化合物,经过LSD1活性筛选发现引入肼基的化合物D8(IC50=0.88±0.01 μM)具有最强的LSD1抑制活性。重组蛋白水平的研究结果表明,化合物D8是可逆性、选择性和底物竞争性LSD1抑制剂。在A549细胞中,化合物D8能够与LSD1结合并抑制其活性;此外,化合物D8还能够抑制A549细胞的转移能力和EMT过程。动物水平的实验结果表明,D8能够抑制小鼠尾静脉注射A549细胞模型的肺转移,与细胞实验结果一致。化合物D8的发现说明芳肼结构是一个新型的LSD1抑制剂骨架,为获得活性更好的LSD1抑制剂提供了重要指导。(2)EGFR/LSD1双靶点抑制剂的发现及抗肿瘤活性研究对部分EGFR酪氨酸激酶抑制剂进行筛选,发现结构母核是嘧啶的奥西替尼具有LSD1抑制活性(IC50=3.98±0.30μM)。重组蛋白水平实验表明,奥西替尼是可逆性、选择性和FAD竞争性LSD1抑制剂。细胞水平实验结果表明,奥西替尼能够抑制NCI-H1975细胞的增殖,同时,它还能抑制细胞内LSD1的活性并且显著抑制细胞的转移能力和EMT过程。分子对接结果表明,质子化的N,N-二甲基和LSD1第556位天冬氨酸残基之间形成离子间相互作用力,羰基和LSD1第335位苏氨酸残基之间产生氢键,它们对奥西替尼抑制LSD1的活性有重要贡献。奥西替尼具有LSD1抑制活性这一发现为设计活性更好EGFR/LSD1双靶点抑制剂提供了结构优化方向。(3)异喹啉生物碱类LSD1抑制剂的发现及抗肿瘤活性研究对部分生物碱进行筛选,发现异喹啉类生物碱具有较好的LSD1抑制活性,其中表小檗碱(IC50=0.14±0.01μM)对LSD1的抑制活性最强。重组蛋白水平的实验结果表明,表小檗碱是可逆性、选择性和底物竞争性LSD1抑制剂,并且以快结合慢解离的方式作用于LSD1。细胞水平的实验结果表明,表小檗碱能够抑制急性髓细胞白血病细胞THP-1和HL-60的增殖,抑制细胞内LSD1的活性并促进细胞分化。动物水平的实验结果表明,表小檗碱能够抑制THP-1细胞移植瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存时间,说明表小檗碱具有在体抗肿瘤活性。异喹啉生物碱类LSD1抑制剂的发现为获得活性更好的LSD1抑制剂提供了新的结构骨架。(4)LSD1 neddylation修饰的相关研究神经发育下调因子 8(neural precursor cell expressed developmentally down-regulatedprotein8,nedd8)是与泛素结构相似的分子,广泛参与蛋白质翻译后修饰过程,修饰过程被称为neddylation。我们使用过表达nedd8和抑制剂MLN4924刺激正反验证的方法,得出neddylation降低LSD1稳定性的结论。同时,利用截断突变、缺失突变和定点突变的LSD1质粒与nedd8质粒共转染的方法,初步确定neddylation修饰位点主要是氮端165位氨基酸中的K5/6/63/117。综上所述,本论文共发现三种含氮杂环的LSD1抑制剂,并对化合物D8、奥西替尼和表小檗碱进行了深入的LSD1抑制机理和抗肿瘤活性评价。此外,还发现neddylation能够降低LSD1的稳定性,并初步确定LSD1氮端165位氨基酸中的K5/6/63/117是修饰位点。这些发现为进一步揭示LSD1的生物学功能及基于LSD1的抗肿瘤药物研发提供实验基础和理论依据。