论文部分内容阅读
研究背景骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是最常见的一种关节炎,是导致老年人慢性疼痛和残疾的主要原因之一,全球约有2.5亿患者遭受骨关节炎的困扰。OA的病理特征主要包括关节软骨退变和慢性炎症,且随着疾病的发展,病变会涉及整个关节,包括软骨下骨及滑膜,关节周围的肌肉和韧带也会发生相应改变。OA症状可表现为关节的疼痛、畸形、稳定性降低及运动功能减退。疼痛是骨关节炎的主要症状,且疼痛与关节功能受限、情绪困扰、睡眠问题及总体生活质量下降密切相关。因此,探寻OA的发病机理及有效治疗方法成为临床研究的热点。衰老是60岁以上成年人OA的主要危险因素之一。软骨老化的表现主要包括软骨细胞的生物合成障碍及软骨细胞的死亡,而自噬水平降低是导致软骨细胞功能改变的重要原因。研究发现衰老可导致软骨细胞的自噬水平降低,且衰老引起的自噬损伤发生于软骨细胞减少和结构损伤之前。自噬也称为II型程序性细胞死亡,是细胞的一种自我保护机制。自噬可分为三种类型:分子伴侣介导的自噬、巨自噬和微自噬,未做特殊说明时通常所指为巨自噬。在细胞缺氧、低能量供应或其他刺激时,自噬可以清除功能障碍和受损的细胞器和大分子,在维持细胞稳态和代谢中起到重要作用。研究表明,与正常软骨细胞相比,OA软骨细胞中自噬相关蛋白ULK1(Unc-51-like kinase 1,ULK1)、Beclin-1、LC3B 表达降低,更重要的是,在软骨变性过程中,与自噬相关的基因表达水平也相应降低。另有研究发现自噬的减少会增加糖尿病患者软骨变性的风险。目前自噬在OA软骨细胞中的主要作用已得到公认,但其确切的分子作用机制还有待于进一步探究。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是属于核受体超家族的配体激活转录因子家族。迄今为止,已鉴定出三种PPAR亚型:PPARα,PPAR β/δ和PPAR γ,PPARγ是研究最多的PPARs形式。研究发现PPARγ在软骨细胞中表达并具有功能活性,PPARγ活化后可抑制IL-1诱导的软骨细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、环加氧酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和微粒体前列素 E 合酶-1(Microsomal prostaglandin E synthase-1,mPGES-1)的表达且 PPAR γ 激活剂预处理可防止 IL-1β诱导的蛋白多糖降解。此外,实验发现PPARγ在关节软骨中的缺乏可能部分地导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号传导的上调,导致自噬的抑制以及分解代谢活性增加,加速OA的进展。通过上述PPARγ与OA的关系,能够发现PPARγ可通过提高软骨细胞的自噬、降低炎症的表达来减少软骨细胞的死亡,这可能为治疗OA提供了新的思路和靶点。臭氧(Ozone,03)是一种自然的、高度不稳定的大气气体,它能迅速分解为氧分子和氧原子。科学研究表明臭氧作为一种强氧化气体,高剂量臭氧可引起严重的氧化应激导致炎症反应和组织损伤,低浓度臭氧可诱导中度氧化应激并激活抗氧化通路。在过去几十年里,研究发现臭氧具有杀菌、免疫调节、镇痛和抗炎的特性,且臭氧越来越多地作为O2-03混合物应用于临床医学。在临床实践中,医用臭氧可用于治疗伤害性疼痛、神经病理性疼痛,缓解其炎症和变性过程,在肌肉骨骼系统,尤其是对退行性椎间盘疾病和椎间盘突出症有良好疗效,目前在欧洲和亚洲应用较广泛。临床中,关节腔注射低浓度(≤30ug/mL)医用臭氧可以抑制炎性因子的产生,改善软骨退变,减缓疼痛症状。但目前关于医用臭氧对OA的治疗机制研究不多,有待于进一步探究。课题组前期研究发现,30ug/mL医用臭氧体外干预可通过AMPK/mTOR信号通路提高OA软骨细胞的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、ULK1、Beclin-1的表达,抑制OA软骨细胞分泌白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)及基质金属蛋白酶MMP-13,同时提高组织金属蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitors of metalloproteinasel,TIMP1)表达。同时体内研究发现,在大鼠OA模型关节腔内注射30ug/mL医用臭氧可提高OA大鼠的机械痛阈,改善膝关节的表面光滑度,降低IL-6、TNF-α的表达。以上研究表明适当浓度的医用臭氧可以改善OA的炎症和分解代谢,并可以通过AMPK/mTOR促进软骨细胞的自噬,减缓OA的发展进程。然而,医用臭氧对OA的治疗机制仍待完善,因此我们假设适当浓度的医用臭氧可以提高OA软骨细胞中PPAR γ的表达,通过PPAR γ/mTOR信号通路调节软骨细胞自噬,并且降低炎症因子的表达,改善炎症对OA软骨细胞自噬的抑制,降低软骨细胞的分解代谢,延缓关节软骨的退变。目的观察不同浓度医用臭氧对大鼠OA软骨细胞活力的影响;探究医用臭氧对OA软骨细胞中PPARγ/mTOR自噬信号通路及炎症因子IL-6、TNF-α及基质分解蛋白MMP-13、MMP-3表达的影响。方法选取出生3d以内的Wistar大鼠,获取四肢关节软骨进行原代软骨细胞的分离培养,通过甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光进行软骨细胞的鉴定。将原代软骨细胞随机分为正常对照组(Control组)、模型组(IL-1β组)和30、50及70μg/mL03组。除Control组外,其余组别通过10ng/mL的IL-1β刺激24h构建骨关节炎软骨细胞模型,并采用不同浓度的臭氧处理30min,通过CCK-8法对所有组别进行软骨细胞活力测定,筛选出最佳臭氧浓度进行后续实验。构建OA模型,将原代软骨细胞随机分为Control组、IL-1β组、IL-1β+03组及Control+03组,应用Western blot及qRT-PCR方法检测医用臭氧对软骨细胞中PPAR γ蛋白及自噬相关蛋白LC3Ⅱ及P62蛋白的表达的影响。随后加入PPAR γ特异性抑制剂GW9662处理12h,再给予30 μg/ml臭氧处理,并将原代软骨细胞随机分为Control组、IL-1β 组、IL-1β+03组、IL-1β+03+GW9662 组及IL-1β+GW9662 组。应用 Western blot方法检测GW9662对OA软骨细胞中PPAR γ蛋白及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、P62及Beclin-1蛋白表达的影响,并检测P-mTOR、mTOR及ULK1蛋白的表达。qRT-PCR检测IL-6、TNF-α及MMP-3、MMP-13的mRNA表达水平。免疫荧光染色检测软骨细胞的自噬相关蛋白LC3Ⅱ及P62的表达。电镜检测OA软骨细胞中的自噬小体数目。结果经甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定,所分离培养的细胞96%为软骨细胞。不同浓度臭氧处理后,CCK-8结果显示,与Control组相比,IL-1β组、50μg/mL及70 μ g/mL臭氧组OA软骨细胞的活力显著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01);与IL-1β组比较,30μg/mL臭氧组OA软骨细胞的活力显著升高(P<0.01)。此外,Western blot结果显示,与Control组相比,IL-1 β组中PPARγ及LC3Ⅱ蛋白表达下降(P<0.01,P<0.05),P62蛋白的表达升高(P<0.01);与IL-1β组相比,IL-1β+O3组中PPARγ及LC3Ⅱ蛋白的表达升高(P<0.01,P<0.05),P62蛋白的表达降低(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,与Control组相比,IL-1 β组PPARγ的mRNA表达显著降低(P<0.01);与IL-1β组相比,IL-1β+03组PPAR γ的mRNA表达升高(P<0.01)。为探究医用臭氧促进OA软骨细胞的自噬是否与PPAR γ激活有关,加入PPAR γ特异性抑制剂GW9662(20 mM/mL)。Western blot结果显示,与IL-1β组相比,IL-1β+O3组中Beclin-1蛋白表达升高(P<0.05);与 IL-1β+O3组相比,IL-1β+O3+GW9662 组 Beclin-1及LC3Ⅱ的表达下降(P<0.05,P<0.05),P62的表达升高(P<0.01)。细胞免疫荧光结果显示,与IL-1β组相比,IL-1 β+O3组中LC3Ⅱ蛋白的免疫荧光强度增强,P62蛋白的免疫荧光强度减弱;与IL-1β+O3组相比,IL-1β+03+GW9662组及IL-1β+GW9662组中LC3Ⅱ蛋白免疫荧光强度减弱,P62蛋白的免疫荧光强度增强。为验证医用臭氧通过PPARγ/mTOR信号通路的激活促进OA软骨细胞的自噬,加入GW9662(20 mM/mL)后,采用 Western blot 方法检测 PPARγ、p-mTOR 及 ULK-1 蛋白的表达,结果显示,与Control组相比,IL-1 β组中p-mTOR表达升高(P<0.05),ULK-1蛋白表达差异无统计学意义;与IL-1 β组相比,IL-1β+O3组ULK-1蛋白的表达升高(P<0.05),p-mTOR表达降低(P<0.05);与IL-1β+O3组相比,IL-1β+03+GW9662组中PPARγ及ULK-1蛋白的表达降低(P<0.01,P<0.05),p-mTOR表达升高(P<0.05)。此外,实验中采用qRT-PCR方法检测医用臭氧对炎症因子及ECM分解蛋白表达的影响,qRT-PCR结果显示与Control组相比,IL-1β组中IL-6、TNF-α及代谢分解蛋白MMP-13、MMP-3的表达升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05);与 IL-1β 组相比,IL-1β+O3组中IL-6、TNF-α及代谢分解蛋白MMP-13、MMP-3的表达下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05);与 IL-1 β+O3组相比,IL-1β+03+GW9662 组中 IL-6、TNF-α 及代谢分解蛋白 MMP-13、MMP-3 的表达显著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。电镜观察到,与Control组相比,IL-1β组中OA软骨细胞中自噬小体减少;与IL-1β组相比,IL-1β+O3组中自噬小体增多;与IL-1β+O3组相比,IL-1β+O3+GW9662组及IL-1β+GW9662组自噬小体显著减少。结论30 μ g/mL医用臭氧可提高OA软骨细胞活性及自噬水平,且通过PPAR γ/mTOR自噬信号通路对OA软骨细胞的自噬起到促进作用。此外医用臭氧可通过PPAR γ的激活抑制OA软骨细胞炎症因子及细胞外基质降解因子的转录,为医用臭氧治疗OA提供了一定的实验依据。