PLCD1是Plcd1基因编码的蛋白，属于磷脂酶C家族δ亚型，在磷酸肌醇代谢和Ca2+平衡中发挥重要作用。我们的目标是建立Plcd1转基因小鼠，结合前期本实验室自主培育的Plcd1缺失小鼠snthr-1Bao，在整体动物水平研究Plcd1的生物学功能。本实验从Plcd1表达载体的构建和显微注射法制备Plcd1转基因小鼠两个方面介绍如下：　　 第一部分pEF6/V5-His-Plcd1真核表达载体的构建。　　 目的：扩增Plcd1目的基因片段，获得能在哺乳动物细胞中表达PLCD1融合蛋白的表达载体。方法：通过RT-PCR方法获得Plcd1目的片段，将其与pMD19-T载体连接、转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选、PCR检测及DNA测序，获得pMD19-T-Plcd1重组质粒；以重组质粒为模板，通过引物设计及PCR方法在Plcd1目的基因两端引入合适的酶切位点，将纯化的PCR产物和pEF6/V5-His-LacZ表达载体分别进行酶切、纯化、回收、连接、转化DH5α感受态细胞，再经Amp筛选、PCR检测及DNA测序，获得pEF6/V5-His-Plcd1表达载体；在此基础上，通过电转染的方法，将pEF6/V5-His-Plcd1表达载体导入L929细胞，经间接免疫荧光法检测PLCD1融合蛋白的表达。结果：本实验成功扩增了长2271bp的Plcd1目的片段，将其与pMD19-T载体连接获得了pMD19-T-Plcd1克隆载体；以克隆载体为模板，通过PCR方法分别在Plcd1目的基因上下游引入了SpeI和BstBI两个酶切位点，PCR产物与pEF6/V5-His-Lac Z经酶切、回收、连接、转化、筛选及测序等一系列步骤，最终获得了pEF6/V5-His-Plcd1表达载体；电转染L929细胞后，经间接免疫荧光法检测到PLCD1融合蛋白在细胞质中表达。结论：本实验成功扩增了全长2271bp的Plcd1目的片段，并先后构建了pMD19-T-Plcd1克隆载体及能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白的pEF6/V5-His-Plcd1表达载体。　　 第二部分显微注射法制备Plcd1转基因小鼠。　　 目的：在成功获得pEF6/V5-His-Plcd1表达载体的基础上，通过显微注射法获得Plcd1转基因小鼠。方法：pEF6/V5-His-Plcd1表达载体经酶切、电泳、纯化后，选择包括hEF-1α启动子、Plcd1目的片段、V5、His-tag和BGH的线性构件用于显微注射；供体、受体小鼠经同步发情或超排卵处理，采集受精卵用于显微注射；经显微注射后的受精卵适当培养，选择优质胚胎进行受体小鼠的输卵管移植；出生小鼠经基因组DNA提取及PCR检测，初步确认获得Founder转基因小鼠。结果：pEF6/V5-His-Plcd1经NruI和AseI双酶切纯化后，成功获得了用于显微注射的目的片段；显微注射共681枚受精卵，经培养后多数溶解，仅存活优质胚胎393枚，存活率为57.7％；存活胚胎全部用于移植，共移植了18只受体小鼠，13只小鼠怀孕，获得82只仔鼠。经PCR初步检测，成功获得了15只Plcd1转基因阳性小鼠，阳性率为18.3％。结论：经PCR检测，本实验初步获得了15只Plcd1转基因首建小鼠，为Plcd1基因功能的研究提供了新的动物模型。