论文部分内容阅读
细胞周期进程决定于称之为调节亚基的周期素（cyclins）和称之为催化亚基的周期素依赖的蛋白激酶（CDKs）的结合与相互作用，同时也受到细胞周期的负调控因子—CDKs的抑制因子CDIs家族成员的调控。CDIs包括CIP／KIP(p27kip1、p21Cip1及p57Kip2)和INK4（p15、p16、p18、p19）两个家族。在细胞周期进程中，调控G1期进程和G1→S期相转换的分子事件主要涉及：周期素蛋白—cyclin D和cyclin E的表达，分别与搭配分子—CDK4／CDK6；CDK2激酶结合形成：cyclin D-CDK4／CDK6和cyclin E／CDK2复合物，cyclin D-CDK4／CDK6主要在G1中期和后期发挥作用，而cyclin E／CDK2活性主要在G1→S期行使功能，cyclin E是G1→S转换中主要的限速因子之一。而外源性或内源性损伤信号，直接对G1、G2期进行负调控的，主要是具有多种重要生物学功能的CDKs抑制因子—p27kip1、p21WAF／cip1蛋白家族分子。p21WAF／cip1和p27kip1能与cyclin D-CDK4／CDK6和cyclin E／CDK2复合物结合，参与细胞周期G1期检查点的调控。 真核细胞在长期进化中形成了一套在细胞周期中保证基因组DNA得以忠实复制，染色体质量得以精确分配的检查机制，通常被称为细胞周期检查点。其中，发生在G1／S和G2／M期的DNA damage checkpoint的调控对于细胞命运的抉择具有重要意义!这是因为细胞在受到诸如电离辐射等基因毒应激损伤时，细胞最先作出的细胞学反应：一，起始DNA damage checkpoint使细胞周期阻滞（arrest）在G1期，赢得时间识别与修复损伤，避免损伤的DNA进行错误的复制，或／和阻滞在G2期，避免缺陷的染色体进一步分裂；二，损伤严重而修复无望启动细胞死亡程序，清除那些带有病变倾向的细胞危害机体。 p27Kip1是一种广谱的CDKs抑制因子，在静止的细胞和G1期细胞，它能抑制cvclin D-CDK4／CDK6和cyclin E／CDK2的活性。p27Kip1水平升高时形成p27Kip1-cyclin E／CDK2复合体，直接并完全抑制cyclin E／CDK2复合物的酶活性，与p15协同使细胞周期阻滞在G1晚期。然而，在不同条件下，p27Kip1参与周期调控的机制也不相同，例如：TGF-β处理的细胞，p27Kip1以对cyclin E／CDK2结合为主。另博士论弈......一一一一一一一一一一一一一立左鱼制也不相同，例如:TGF一p处理的细胞，p27Kip，以对eyelin EzeD心结合为主。另一方面，p27KIP’的活性水平及功能作用，因细胞类型不同而各异，又受多种因素的影响，如一些有丝分裂原cAMP、雷帕霉素可以上调p27Kip，的表达，而IL一2等则与p27Ki”‘的表达下降有关，受电离辐射（IR）照射的成纤维细胞瘤及用1，25一二经基D3处理的HeLa细胞系在Gl期均有游离的p27脚‘的积累，细胞周期阻滞在Gl期;而在痣癌伽BccS)细胞中，Y一射线能诱导p27吻‘表达水平的显著下调，细胞周期阻滞在G2舰期。Craig等人的大量研究进一步揭示p27Ki”，还参与细胞增殖、分化和凋亡等重要细胞活动。然而最重要的是，在DNA损伤反应中，P2尹”’的表达水平是它能否发挥其检查点蛋白功能的关键。 在本论文中，我们主要进行了以下三个方面的研究:一不同剂量电离辐射（!R）对细胞周期G1/S检查点的影响 cycnn E/CDKZ激酶活性在ZGy照射后lh略有下降，3h略有回升，12h活性达到最大;10Gy照射后其活性从lh开始增加，12h活性达到最大。 cyclinE蛋白表达水平在ZGy照射后略有增加，1 OGy照射后lh开始增加，持续到24h，但IR后cdkZ蛋白水平未发生变化，通过免疫共沉淀检测了10Gy照射后edkZ与cydinE结合，发现随着照射时间的延长，cyclinE与cdkZ结合量增多，这说明cyclinE蛋白水平的增加能反映cyclin E/CDKZ的激酶活性。 eyClinE/enKZ的负调控因子p27K，p’蛋白表达水平在Zoy照射后lh略有增加，6一9h开始下降;10Gy照射后3h开始下降，持续到24h，可见，随着IR剂量的加大和处理时间的延长，p27KIP‘蛋白表达水平下降的程度加大。1 OGy照射后cyclinE/cDKZ复合物中p27KIPI蛋白结合量减少，这表明IR诱导p27Ki”，蛋白表达水平的下降，进而失去对cyclin E/CDKZ的抑制活性。 与p27Ki”，表达水平不同，pZI蛋白表达水平在ZGy照射后略有增加，6一gh略有下降，在照后24h达到最大;10Gy照后1一3h开始增加，持续到24h，并且cyclin E/CDKZ复合物中pZI蛋白结合增多，但cyclin E/CDKZ激酶活性并未受到抑制，除了因IR诱导cydinE蛋白表达水平增加外，另一重要的原因就是与pZI同一家族的p27KIP，蛋白表达水平下降，失去了对cyclin E/cDKZ的抑制活性。表明:p27Ki”‘是更主要的调控cyclinE/cDKZ激酶活性的周期检查点调控蛋白。二泛素化蛋白酶体途径参与IR诱导周期检查点蛋白p27Ki”表达的下调 已有的研究报道揭示:在真核细胞中，泛素化蛋白酶体降解系统调控着p27KIP’博士论文中文摘要的适时表达和表达水平。我们知道IR能激活泛素化蛋白酶体途径，那么，泛素化蛋白酶体途径是否参与IR诱导p27物’蛋白表达的调控?我们通过初步的研究结果揭示:Northem检测结果表明IR对p27KIP‘mRNA水平无明显影响;IR诱导p27KIP