棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV)是一类双链环状DNA病毒,其分子生物学和基因功能研究已取得很大进展。开放阅读框109 (open reading frame 109, orf 109)是HaSNPV的一个功能未知基因,本文首次对HaSNPV G4株基因组中的orf109进行研究报道。orf109基因及其编码蛋白HA109的序列经过生物信息学软件分析后显示：orf109全长357bp,编码118个氨基酸组成的肽链,预测蛋白质分子量大小为13.6kDa; orf109起始密码子上游-235位和-238位均存在早期启动子特征序列CAGT, TATAA,表明orf109可能是一个早期表达基因。Ha109是HaSNPV G4株特有的一个未知功能基因,由于其具有核输出信号,推测该基因很可能在宿主细胞核物质及能量运输,信号传递等方面起着特定作用：通过同源核酸及蛋白序列比对发现只与同种美洲棉铃虫HzSNPV orf112有99%以上同源性,仅具有几个核苷酸差异,但并不影响所编码的蛋白质的序列,因此核酸序列的差异反映了进化上的不同;orf109很可能是病毒在进化过程中不断重组和重排产生的新基因,但具体机理还不清楚。所以Ha109基因功能的研究对于阐明该基因的独特性及进化史具有重要意义。本试验中,我们利用表达载体pGEX-KG将orf109编码蛋白与谷胱甘肽S转移酶(GST)在表达宿主大肠杆菌BL21中融合表达,表达产物约为38.5KDa,与预期的大小相符。表达蛋白经初步纯化(包涵体纯化和凝胶电泳分离相结合),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经western-blot检测,获得了特异性较强的抗体,为进一步研究HA109蛋白的表达时相及其在病毒颗粒上的定位打下了基础。同时,我们也探索了GST-HA109融合蛋白的可溶性表达条件,我们发现融合蛋白主要以包涵体形式表达,在我们所尝试的任何条件下可溶性融合蛋白表达量都很低。为研究orf109的功能,我们通过同源重组在原核水平将该基因orf109敲除,构建orf109基因缺失型重组病毒。首先我们通过构建克隆的方法在pKS-egfp-Cmr质粒Phsp70-egfp-SV40-Cmr两端分别加上orf109的上下游同源臂,然后酶切回收带有同源臂的ha109UP-Phsp70-egfp-Cmr-ha109D0线性片段,借助编码λ噬菌体Red-ET线性重组酶系统的质粒pKD46及棉铃虫杆状病毒细菌人工染色体HaBacHz8,在大肠杆菌BW25113中进行同源重组。通过PCR及酶切鉴定,我们得到了orf109缺失型重组病毒HaBacΔ109。为系统分析orf109在病毒复制周期中的作用,我们利用Bac-to-Bac系统构建了带有绿色荧光蛋白egfp基因和多角体编码基因polyhedrin的四种基因型重组病毒：orf109缺失型重组病毒HaBacKO, orf109单回复型重组病毒HaBacSingleRep,orf109双回复型重组病毒HaBacDualRep,野生型对照重组病毒HaBacWt。四种基因型重组病毒的构建,为我们今后在细胞水平上研究orf109对病毒基因组的复制、出芽病毒滴度、包涵体病毒组装等方面的影响打下了重要基础。