研究目的补骨脂是临床常用且重要的补益药,也是治疗白癜风的有效中药。近年来有关补骨脂肝毒性的临床报道屡见不鲜,引起了广泛关注。补骨脂在临床的长期应用是否会导致其他组织器官的蓄积而造成潜在毒性尚未得到临床依据,也未见系统的研究,但在以往的研究中多报道补骨脂整体提取液具有肾毒性、生殖毒性、光毒性等,且具体致毒单体成分和深入机制还有待进一步研究。补骨脂二氢黄酮是补骨脂中的重要效毒成分,实验室前期经过高内涵筛选补骨脂中重要组成部分,发现补骨脂二氢黄酮是引起肝细胞内质网应激的主要单体成分。本研究接续前期研究成果,以补骨脂二氢黄酮为研究对象,进行系统的体内外实验,探索补骨脂二氢黄酮的潜在毒性靶器官及深入探讨其毒性机制,为其临床安全应用提供理论基础和科学依据。研究内容研究以模式生物斑马鱼作为研究对象,以体内、体外和离体的方式,首先重点围绕补骨脂二氢黄酮的毒性靶器官展开,识别出以肾脏、卵巢为代表的毒性靶器官。在此基础上从内质网应激的角度探讨肾毒性和生殖毒性的相关机制以及干预靶点。研究方法根据幼鱼和成鱼的急性毒性实验结果模拟LC50和BMDL,并据此确定后续给药浓度。对幼鱼的毒性检测主要通过拍照录像观察统计BV对肝、脊索的影响和自主运动情况。对成鱼靶器官毒性的初步分析主要通过观察心、肝、肾、卵巢、肌肉HE染色病理结果,并用高效液相检测心、肝、肾、脑、卵巢、肌肉中的药物分布情况。通过Masson染色进一步确定肾毒性表征,并采用原位杂交检测AQP1和N-Cadherin分子的变化情况。体外验证HK2细胞给药BV后CCK-8检测细胞活力,确定后续给药浓度,Western Blot实验分别检测纤维化、EMT、内质网应激相关蛋白表达,钙离子探针Fluo-4-am染色检测钙超载情况,Mitosox染色检测活性氧含量,均用活细胞成像仪拍摄图像。进一步通过内质网应激的抑制剂4-PBA和激动剂衣霉素、活性氧清除剂NAC对活性氧引起的内质网应激介导的EMT相关肾纤维化通路进行验证。并以钙离子超载为终点指标,筛选天然化合物,用筛选得到的人参皂苷Rb1验证通路的有效性。按照OECD标准通过称重计算生殖毒性黄金指标肝体指数、性腺体指数,Elisa法检测卵黄蛋白原含量进一步确认对内分泌的扰乱。原代培养斑马鱼卵泡,台盼蓝染色检测存活率,确定原代培养成功。体外给药BV 4小时后检测离体卵泡存活率、成熟率。并用Fluo-4-am染色检测钙离子超载情况,原位杂交检测内质网应激相关分子的变化。进而用4-PBA验证内质网应激与卵泡闭锁之间的关系,q PCR检测内质网应激相关分子转录水平,利用数据库中BV与Bip的分子模型模拟对接。研究结果1.斑马鱼胚胎LC50值为10.89μM,死亡率与浓度和时间呈现明显的相关性,40μM组开始全部死亡。后续选取0.25,0.5,1μM进行实验。BV对斑马鱼幼鱼自主运动等指标均未产生影响,但能看到肝脏变性,高浓度组对体长略有影响。斑马鱼成鱼雌鱼的LC50值为6.012μM,BMDL值为2.55μM,后续选取1/2,1/4,1/8BMDL为高、中、低剂量,且没有对一般指标如条件因子和自主运动情况产生影响,说明可以作为后续给药剂量。BV进行高效液相标准曲线建立,得到浓度与响应值之间的趋势线方程为y=0.57168x+1.4866,R~2=0.9998。BV在0.5 ng/m L-500ng/m L范围内,线性关系良好,最低定量限为0.5 ng/m L。斑马鱼半静态给药BV 21天之后,在各组织中均有分布。药物浓度从大到小依次为肾＞肝＞卵巢＞肌肉＞脑＞心脏。经过长期给药后,药物明显在肾中的蓄积多于肝脏,达到了119.14±49.22ng/m L。病理切片结果显示高中低剂量BV未对斑马鱼成鱼雌鱼的心脏、肌肉产生影响,但中高剂量下,肝脏细胞排列出现混乱,核仁萎缩,肾脏核质比增加,管径减小,卵巢的各级卵泡分布没有影响但闭锁数目显著增加。2.BV处理组斑马鱼肾小管上皮细胞顶端和基底部以及间质中出现明显增加的蓝色染色,并且在整个样本中弥漫性扩张,即胶原沉积,说明BV处理后斑马鱼发生了肾纤维化,进一步探索纤维化机制发现,肾小管上皮标志物AQP1的转录水平在BV给药21天后显着降低,但作为EMT标志物之一的N-cadherin的含量显着增加,说明纤维化与EMT相关。体外实验验证这一结果,首先确定给药剂量,25μM BV给药HK2人肾小管上皮细胞,活力降低至82.10±2.43%。在25μM以下设置4个浓度给药,BV不但呈剂量依赖性增加纤维化相关蛋白TGF-β1、Smad 3、α-SMA、Notch1、NICD、c-Myc和Hes1的表达;同时也干预EMT过程,上调HK2细胞中Vimentin、ZEB1和slug的含量,但降低Claudin1和ZO-1的表达。此外,BV给药导致人肾小管上皮细胞中特定功能蛋白的丢失,包括ATP1A1、AQP1和SLC22A6。与体内实验结果一致,BV治疗组中Bip、p-perk、p-e IF2α、ATF4、IRE1α和CHOP的表达明显升高,呈剂量依赖性,而XBP1s的表达明显降低。BV治疗组和对照组的ATF6含量没有显着变化,Ca2+超载明显增强,细胞内ROS升高。4-PBA明显逆转了BV引起的纤维化、EMT、内质网应激相关蛋白表达升高,钙超载和活性氧含量升高的情况,而衣霉素给药则出现类似BV的纤维化、EMT、内质网应激相关蛋白表达升高。活性氧清除剂NAC和人参皂苷Rb1明显逆转了BV引起的纤维化、EMT、内质网应激相关蛋白表达升高,钙超载和活性氧含量升高的情况。3.斑马鱼成鱼雌鱼给药21天BV后肝体指数、性腺体指数、卵黄蛋白原含量均增加。离体卵泡存活率达89.33%,确定原代培养成功。卵泡存活率和成熟率随BV剂量升高而依赖性下降,BV也引起钙离子超载及ATF6,XBP1s,IRE1α转录水平明显上调。4-PBA明显逆转了BV引起的卵泡存活率和成熟率下降,ATF6,XBP1s,IRE1α转录水平明显上调以及钙超载情况。BV与Bip分子进行分子对接,BV在Bip分子两条链之间的口袋中与Bip结合,BV的羟基与Bip上的氨基酸残基形成氢键。结论1.本研究系统探索了BV对模式生物斑马鱼幼鱼和成鱼的毒性靶器官,明确在无急性毒性剂量长期暴露情况下,肾、肝、卵巢组织作为是BV分布前三的器官,出现明显的器质性损伤。提示补骨脂类药物临床应用时,除了关注肝毒性外,也应注意其潜在的肾毒性与生殖毒性。2.本研究首次发现无急性毒性的BV可导致肾纤维化,初步明确是通过活性氧引起的内质网应激诱导EMT相关的肾纤维化,并通过这一通路筛选到人参皂苷Rb1,为后续深入探讨BV肾纤维化机制奠定基础,为肾纤维化治疗提供新的思路,为人参皂苷Rb1的抗纤维化作用提供证据。3.本研究首次从体内与离体证实BV可诱导斑马鱼卵泡闭锁,初步明确这一效应是通过内质网应激引起的,并通过建立离体培养卵泡模型进行离体验证,为后续体内研究和离体深入探索提供科学依据。4.本研究提示,BV潜在肾毒性和生殖毒性与ER应激密切相关,代表通路Bip/e IF2α/CHOP可能补骨脂类药物临床毒性防治的重要潜在干预靶点。