研究背景当今社会,人口老龄化程度不断加剧,各类神经系统退行性病变,如阿尔茨海默病、帕金森病等的发病率日益增长,对人们的日常生活和工作产生了重要影响。阿尔茨海默病为导致痴呆最主要的疾病,近年来得到了越来越多的关注。然而,迄今为止,阿尔茨海默病药物治疗的临床效果欠佳,可能是因为阿尔茨海默病致病机理复杂,且临床症状出现较晚,疾病晚期进行治疗干预使得效果受限,若能在疾病早期阶段给予干预治疗,或许可有效阻止疾病进展,获得较好预后。因此,对于阿尔茨海默病的早期诊断和治疗显得尤为重要。突触是神经元间信息传递的纽带,在阿尔茨海默病的发病过程中,突触损害出现早,且与认知水平密切相关。近年来,突触的重要性受到越来越广泛关注。研究发现APP/PS1双转基因小鼠脑内早期即可有老年斑神经元纤维缠结形成,行为学实验证实其在6月龄即出现明显学习和记忆功能障碍。APP/PS1小鼠常被用来模拟阿尔茨海默病的病理改变,应用于基础研究,在国际上受到广泛认可。黄酮类化合物在自然界中分布广泛,目前已有大量研究证实,可可、蓝莓、银杏叶、茶叶等植物中提取的黄酮具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗癌等多种生物活性。当前已发现柿叶中黄酮类提取物(flavonoid extract from leaves of Diospyros kaki, FLDK)可有效改善缺血所致的脑损伤,防止神经元的兴奋性毒性作用,且副作用小。从柿叶提取的黄酮类化合物可能成为最有潜力防治阿尔茨海默病的天然药物,然而目前柿叶黄酮提取物对学习记忆能力及突触的作用国内外鲜见报道。本实验采用国际广泛认可的APP/PS1双转基因小鼠作为阿尔茨海默病模型,探讨柿叶黄酮提取物对认知水平及突触的保护作用及可能机制。目的采用APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象,通过行为学检测小鼠认知水平,电镜观察小鼠脑内突触结构,分子生物学技术检测小鼠脑内突触相关蛋白的表达情况,探讨柿叶黄酮类提取物对阿尔茨海默病模型小鼠记忆、突触超微结构及突触相关蛋白表达的影响。方法20只4月龄APP/PS1双转基因小鼠,随机分为模型组(APP/PS1组)、柿叶黄酮提取物干预组(APP/PS1+FLDK组),每组各10只。20只同月龄C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组(NC组),干预对照组(FLDK组)。APP/PS1+FLDK组及FLDK组均给予80mg/(kg·d)柿叶黄酮提取物灌胃干预6个月,APP/PS1组及NC组以同样方法给予等量生理盐水6个月。使用Morris水迷宫试验检测各组小鼠逃避潜伏期(escape latency, EL)及穿越平台次数；透射电镜检测突触的超微结构完整性,Rho GTP酶活性试剂盒及Western blot检测脑组织RhoA、Racl、磷酸化及总ERK1/2、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cyclic AMP response element-binding, CREB)、突触素(synaptophysin, SYP)及大脑发育调节蛋白(development regulation brain protein, Drebrin)的含量,免疫组织化学方法检测脑组织中RhoA、磷酸化ERK1/2、磷酸化CREB的表达。结果1.柿叶黄酮类提取物对APP/PS1转基因模型小鼠行为学的影响柿叶黄酮提取物干预6个月后,与APP/PS1组相比,APP/PS1+FLDK组小鼠EL明显减少(P<0.01),穿越平台次数显著增多(P<0.01)；FLDK组小鼠EL较NC组减少(P<0.05),穿越平台次数较NC组明显增多(P<0.05)。2.透射电镜下观察各组小鼠脑内突触超微结构APP/PS1组突触结构模糊,各部分结构难以辨认；与APP/PS1(?)相比,APP/PS1+FLDK组突触结构较清晰,突触后致密物增厚,突触囊泡增多。NC组及FLDK组突触结构清晰、完整,可见突触间隙及大量突触囊泡,以及较厚突触后致密物。3. Rho GTP酶活性试剂盒检测RhoA-GTP及Racl-GTP的表达APP/PS1小鼠脑内RhoA-GTP表达量明显高于NC组小鼠(P<0.01)；与APP/PS1相比,柿叶黄酮提取物干预6月后可使RhoA-GTP表达明显减少(P<0.05)。而Racl的检测发现,APP/PS1小鼠脑内Rac1-GTP含量明显低于NC组小鼠,APP/PS1+FLDK组小鼠脑内Rac1-GTP含量与未干预的APP/PS1小鼠相比无明显差异(P>0.05)。4. Western blot检测ERKl/2,CREB,SYP及Drebrin在各组小鼠脑内的含量APP/PS1组小鼠经柿叶黄酮提取物干预6个月后,磷酸化ERK1/2、磷酸化CREB、SYP及Drebrin表达均较未干预组明显增加(P<0.01)：与NC组小鼠相比,FLDK组小鼠脑内磷酸化ERK1/2、磷酸化CREB、SYP及Drebrin含量明显增多,差异有统计学意义(P＜0.05)。5.免疫组织化学方法检测小鼠皮层及海马CAl区RhoA的表达部位在APP/PS1小鼠脑内,RhoA阳性颗粒主要存在于神经突上,在细胞内则较少。与APP/PS1组小鼠相比,APP/PS1+FLDK组小鼠RhoA阳性颗粒的分布发生变化,在神经突上表达减少而在胞浆内表达量增多。NC组及FLDK组小鼠脑内,RhoA主要分布于神经元胞浆中,可见胞浆被特异性抗RhoA抗体染成棕黄色。6.免疫组织化学方法检测各组小鼠海马CAl区磷酸化ERK1/2,磷酸化CREB的表达在各组小鼠脑内,可见细胞核被苏木素染成蓝色,磷酸化ERK1/2及磷酸化CREB棕黄色阳性产物在细胞核内表达。APP/PS1组小鼠海马CA1区可见大量蓝色细胞核,棕黄色阳性细胞数很少；与APP/PS1组小鼠相比,APP/PS1+FLDK组小鼠脑内棕黄色颗粒增多,着色较深；FLDK组与NC组海马CA1区可见细胞核内表达有棕黄色颗粒的细胞数最多,且染色深。结论柿叶黄酮类提取物显著提高APP/PS1转基因小鼠及C57BL/6小鼠的认知水平,保护受损突触结构,维持突触结构完整性,增强脑内突触相关蛋白表达。因此,柿叶黄酮提取物可保护突触结构和功能,对阿尔茨海默病具有一定治疗保护作用。