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目的:探究由CBP、NOX2、Ku70及Mre11组成的基因转录调控网络调控人类黑素瘤细胞凋亡、副凋亡及坏死的机制,为发现联合调控ROS及DNA损伤修复机制治疗恶性黑色素瘤的siRNA靶向药物,和CBP缺失所致疾病的分子机制提供一定的研究基础。方法:1.分别设计合成Mre11、Ku70的特异性的siRNA各3对,采用脂质体高效转染试剂Expect2000将siRNA转染进入黑色素瘤A375细胞。2.RT-qPCR检测转染24 h后CBP、Ku70和Mre11的mRNA水平。选用70%敲低效率作为CBP siRNA和Ku70 siRNA、CBP siRNA和Mre11 siRNA单转染及共转染的剂量。3.CCK-8和流式细胞术检测转染24 h后对A375细胞增殖、死亡的影响。4.连续跟踪转染siRNA后A375细胞形态学的变化,流式细胞术转染24 h后检测ROS水平。5.RT-qPCR及Western Blot检测转染24 h后A375细胞NOX2的表达。6.DAPI染色连续跟踪转染24 h后A375细胞核的变化。7.RT-qPCR及Western Blot检测转染24 h后A375细胞中Ku70的表达。8.流式细胞术检测转染24 h后对A375细胞各项周期分布的影响。9.独立重复实验3次,使用SPSS 22.0对结果进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.CBP、Ku70 siRNA以剂量依赖性的方式下调黑色素瘤A375细胞中CBP、Ku70mRNA的表达(P<0.05)。3 fmol/cell CBP siRNA和2.5 fmol/cell Ku70 siRNA的敲低效率均为70%。CBP siRNA、Ku70 siRNA以剂量依赖性的方式抑制了A375细胞的增殖(P<0.05),并诱导细胞出现凋亡、坏死、副凋亡。在70%的敲低效率下,单独或同时敲低CBP和Ku70后对A375细胞死亡产生的影响差异无统计学意义(P>0.05)。单独或同时敲低CBP和Ku70后均使细胞出现细胞质泡沫化。单独或同时敲低CBP和Ku70后均升高细胞内ROS水平(P<0.05)。单独或同时敲低CBP和Ku70后均上调细胞内NOX2的表达(P<0.05)。单独或同时敲低CBP和Ku70后均使细胞出现核降解(P<0.05)。敲低CBP后下调了A375细胞内Ku70的表达(P<0.05)。单独或同时敲低CBP和Ku70后均诱导A375细胞出现S期阻滞。2.Mre11 siRNA以剂量依赖性的方式降低了黑色素瘤A375细胞中Mre11 mRNA的表达(P<0.05)。3 fmol/cell Mre11 siRNA和3 fmol/cell CBP siRNA的敲低效率均为70%。Mre11 siRNA以剂量依赖性的方式升高A375细胞的ROS水平,抑制其增殖,并诱导其凋亡、坏死(P<0.05)。在70%敲低效率下,CBP-Mre11 siRNA组较CBP siRNA组的细胞凋亡率更高,呈叠加效应(P<0.05)。在70%敲低效率下,CBP-Mre11 siRNA组较CBP siRNA组的细胞核降解情况更为严重。在70%敲低效率下,CBP-Mre11 siRNA组较CBP siRNA组的S期细胞阻滞更严重,呈叠加效应(P<0.05),而ROS结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论:单独或同时敲低CBP和Ku70均能通过上调NOX2的表达,A375细胞内受NOX氧化酶调控的ROS水平升高,出现细胞质泡沫化、S期细胞阻滞,诱导细胞副凋亡、坏死。CBP siRNA通过下调了A375细胞内的Ku70的表达量,减少了Ku70-BAX复合物的数量,增加了细胞内游离BAX,BAX触发了线粒体-BAX凋亡途径,使细胞出现以细胞核降解为特征的细胞凋亡。本研究表明CBP、Ku70、NOX2形成了基因调控网络,调节人黑色素瘤A375细胞的副凋亡、坏死和凋亡。Mre11与CBP作用于调控恶性黑色素瘤细胞内ROS水平的同一途径。敲低A375细胞中的Mre11会使ROS升高、S期细胞阻滞而抑制细胞增殖,出现以细胞质泡沫化为特征的坏死;且同时敲低Mre11和CBP后,核降解情况更为严重,表明Mre11可能参与修复CBP敲低所导致的核降解,调控以核降解为特征的细胞凋亡。