自噬是真核生物中一种保守的对细胞内物质周转的通路,靶向结构被自噬小体包裹隔离并递送到溶酶体中进行降解,降解后的物质重新被细胞生物合成所利用。自噬参与许多疾病的病理生理学机制,其调节功能已被证明对于许多特定疾病的攻克有着积极作用。自从20世纪50年代ChirstiandeDuve在电子显微镜(Electron Microscopy,EM)下首次发现自噬小体后,在电镜下对自噬小体等自噬相关结构的观察以及量化分析成为自噬鉴定方法的金标准。溶酶体抑制剂,如巴弗洛霉素A1(Bafilomycin,BafAi)和氯喹(Chloroquine,CQ),被认为具有阻断溶酶体降解的能力,经常在抑制自噬的体外实验中使用并可以互相替换。CQ是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物,因此是最具有广阔临床应用前景的自噬抑制剂。然而,CQ阻止自噬的确切机制仍然未被可靠地证明。化学药物对细胞自噬有影响的同时,很多研究证明病毒感染也能够诱导或抑制自噬,从而利用其相关反应协助病毒复制,或降低被细胞自身代谢更新所降解的可能。猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是属于 alpha-冠状病毒(alpha-Coronavirus,alpha-CoV)亚属的冠状病毒(Coronavirus,CoV),在感染的哺乳期仔猪中造成很高死亡率,并且全球分布广泛,对农业生产特别是生猪产业造成了巨大的经济损失。尽管PEDV在兽医是很重要的一种家畜传染病病原,但关于其与自噬关系的研究很少,在很大程度上仍然是未知的,仅有的少量研究结果阐述了 PEDV与自噬的关系,但这些研究并没有肯定彼此的结果,因此对于PEDV是否诱导自噬尚存争议。同时PEDV在宿主细胞中诱导的细胞内膜结构重塑的研究更基本为空白,乃至整个alpha-Coy仍然没有对其在宿主细胞中诱导的所有形态学改变的时间和全面描述的研究。本研究从使用电镜观察细胞的超微结构变化入手,分析这两种外来物对细胞内结构的影响。我们首先使用Western blot、长寿蛋白降解等多种自噬研究方法对药物处理和病毒感染后的细胞进行分析。然后使用常规电镜的手段对其进行超微结构变化定性和定量的全面分析,随后使用高通量免疫荧光显微镜、免疫电子显微镜(Immuno-EM,IEM)以及自噬功能的多项测定方法分析各超微结构的功能。为了深入全面的探索了其在整个感染生活史中细胞内超微结构变化及膜结构的重组,本研究还选择了时间进程(time course)的方法,结合病毒RNA合成、后代病毒释放、病毒复制等参数来确定不同膜结构出现在病毒生命周期的哪个阶段。本研究观察到两种自噬工具药虽然同为溶酶体抑制剂,但对细胞的超微结构影响有着很大的差别,尤其是CQ,不仅能够诱导与其他溶酶体抑制剂相似的降解小体结构,还有不同的体积较大的液泡产生,同时证明了这种液泡可能具有降解功能。本研究还发现,CQ通过减少自噬小体和溶酶体融合来抑制自噬潮,而BafA1是通过抑制溶酶体降解功能。此外,CQ引起高尔基体和内溶酶体系统的严重混乱,这可能是融合障碍的原因之一。虽然Western blot对微管相关蛋白轻链3(Light Chain 3,LC3)的检测显示PEDV加强了 LC3的脂质化进程,但我们仅仅能够非常低频地观察到自噬小体,但是由于其数量过少、频率过低而不能够进行量化分析。本研究结果发现,PEDV感染能够在形成双层膜囊泡(Double Membrane Vesicle,DMV)、卷曲膜(Convoluted Membrane,CM)和 LVCV 之前,诱导内质网和高尔基体发生显著重组。这些结果与已发表的内容一致,此外,我们还发现,内质网和高尔基体经历了其他CoV未观察到的变化,如内质网增生和高尔基液泡化导致形成称为不规则囊泡簇(Irregular Vesicle Cluster,IVC)的结构。我们还发现,PEDV与HCoV-NL63和TGEV相似,内质网与高尔基是PEDV病毒粒子装配的主要平台。总之,首先本研究通过使用电镜对细胞内部超微结构的观察以及荧光水平标签蛋白的追踪等方法,在与BafA1比较研究中发现了很多差异,认为CQ作为自噬工具药并不能理想替代BafA1,从而填补了相关方面的空白。其次,本研究结果显示PEDV对自噬有一定的诱导作用,这有助于我们了解PEDV感染的发病机制,并为有效的治疗策略的发展提供新的见解。最后,细胞内膜结构系统的支持是细胞行使功能的关键因素。因此推测,PEDV感染诱导的细胞膜结构重排可能是导致猪小肠功能障碍以及腹泻的重要原因。本研究使用电镜以及荧光水平等相关方法,解读调节PEDV诱导膜结构重排生物合成的分子机制可能有助于更精准地开发抑制病毒复制的新型疗法和药物,并且开辟了在体内使用这些疗法和药物作为有效的预防和预防治疗的可能性。