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牙体硬组织的缺失是人体口腔常见疾病之一。但牙釉质是矿化程度高且排列组装有序的天然纳米复合材料,一直以来因结构太过复杂而难以模拟构建。因此,重建釉质样的结构来修复牙体硬组织是目前口腔材料学和修复学学科研究的重点和难点。近年来的研究表明,利用有机大分子作为模板诱导牙体组织仿生矿化从而实现牙体组织修复,有着非常重要的临床意义。本研究利用基因重组技术对AMTN基因进行了克隆和原核表达,将纯化的高纯度AMTN蛋白作为有机模板,用于诱导牙体组织上羟基磷灰石晶体的生长。本论文的研宄内容包括以下几个部分:1.通过提取釉质发育期牙囊组织的细胞总RNA,以逆转录的cDNA作为模板,成功克隆了AMTN基因。并将其与pMD18-T载体相连,构建了pMD18-T-AMTN克隆载体。测序结果表明,克隆所得AMTN基因与NCBI上公布的AMTN基因序列一致。将AMTN基因与pET-28a(+)载体相连,进一步成功构建了pET-28a(+)-AMTN原核表达载体。2.将构建成功的pET-28a(+)-AMTN原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达AMTN蛋白,并对诱导表达条件进行优化。SDS-PAGE分析结果表明,AMTN蛋白在原核表达菌BL21(DE3)中全部以包涵体的形式表达。通过对原核表达系统可溶性表达条件的摸索,将重组原核表达载体转入RossetaTM宿主菌中,进行诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析结果表明,最佳诱导表达条件为0.2mM IPTG,16℃过夜诱导,可实现AMTN蛋白在RossetaTM菌株中以部分可溶性的形式表达。3.根据优化后的表达条件,大量诱导AMTN蛋白表达。表达产物上清中的目的蛋白用镍离子亲和层析法进行了分离纯化,并对初步纯化的目的蛋白用Resource Q阴离子交换层析进行了进一步的分离纯化,获得了纯度高达90%以上的目的蛋白。Western blot检测表明,该检测蛋白能与兔抗组氨酸单抗起特异性反应,且分子量大小为28kDa,说明该检测蛋白是AMTN蛋白。4.AMTN蛋白溶液(100μg/m L)室温孵育进行自组装。用JEOL 2100TEM进行观察,发现AMTN蛋白由散在单体团聚为纳米小球,再组装为串珠网。将厚约1mm的牙片经37%磷酸酸蚀脱矿60s,脱矿牙片浸泡在2mg/m L的AMTN蛋白溶液中,4℃下放置30min,再在矿化液中进行矿化反应。采用SEM分析和XRD分析对牙片上沉积物进行表征,结果表明在近生理条件下矿化所得新沉积的晶体为HA晶体。