牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是我国的十大名花之首,是美好、幸福、吉祥、富贵的象征,深受世界各国人民的喜爱。牡丹的正常花期在每年4-5月份,尽管现在已通过牡丹春节催花技术实现了人们春节赏花的愿望,但由于牡丹的自然花期比较短,一般仅为7天左右,因此仍不能满足人们赏花的愿望。牡丹的花期长短,直接影响到牡丹的观赏质量和牡丹产区的经济效益。延缓牡丹花衰老,延长牡丹花期对促进旅游业的发展具有积极意义,已成为当前急需解决的重要课题之一。本研究以牡丹‘鲁菏红’为试验材料,通过观察自然条件下牡丹花衰老过程中形态、显微结构的变化,确定了牡丹花的衰老时期。利用抑制性消减杂交技术,构建了牡丹花衰老相关基因的抑制消减杂交文库。通过RACE扩增得到3个牡丹花衰老相关基因的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。构建了pBI121-PsMADS4的超表达载体,利用花序侵染法转化野生型拟南芥,观察PsMADS4转基因拟南芥的表型特征。其主要研究结果如下：1.通过对自然条件下牡丹花衰老过程中花的外形和石蜡组织切片的观察,发现花瓣的组织结构变化趋势和花发育不同时期的形态学变化趋势基本一致,并最终确定牡丹花的衰老时期。2.分别以盛开花瓣和衰老花瓣作为tester (driver)和driver (tester),构建牡丹花衰老相关的正向和反向抑制消减杂交文库,最终分离得到211个有效表达序列标签(EST)序列。根据KEGG数据库的BLAST结果,有48个EST序列得到功能注释。将所得211条EST使用COG数据库进行直系同源聚类分析,发现其中44条EST序列被分成14类：未知功能预测；碳水化合物转运和代谢；蛋白质周转,翻译后修饰和分子伴侣；翻译,核糖体结构和生物转化；脂质转运和代谢；无机离子转运和代谢；细胞骨架；转录；细胞壁和细胞膜的生物合成；胞内运输,分泌和囊泡转运；防御机制；氨基酸转运与代谢；次生代谢物的合成,转运和分解代谢；复制,重组和修复。为进一步分析差异表达基因在不同花衰老时期的表达情况,从211条EST序列中随机选取23条EST进行qRT-PCR分析,结果表明,qRT-PCR结果与花衰老相关的抑制消减杂交结果相一致。3.根据消减文库中获得的长链脂酰辅酶A基因的EST序列设计引物,利用RACE扩增得到2377 bp的PsLACS全长cDNA,其中包含1830 bp的编码区,共编码609个氨基酸,分子量为67.94 KD,等电点为6.191。PsLACS包括30个可能的磷酸化位点,这可能与酶活性的调节有关。二级结构预测显示,PsLACS含α-螺旋和无规则卷曲较多。同源性分析结果表明,PsLACS与葡萄LACS同源性最高,其次是橙子LACS、蓖麻LACS。系统进化树分析结果与同源性比对的结果基本一致。4.质膜内在蛋白作为水通道蛋白的一种存在类型,在跨膜水分运输中起着重要作用。以消减文库中获得的水通道蛋白基因的EST序列为模板设计引物,利用RACE扩增得到1174 bp的PsPIP2全长cDNA,其中包含846 bp的编码区,共编码281个氨基酸,分子量为29.79 KD,理论等电点为9.04。PsPIP2包括8个可能的磷酸化位点,推测这些磷酸化修饰位点可能与PsPIP2蛋白通道的开启与闭合相关。二级结构预测显示,PsPIP2含无规卷曲和a-螺旋较多。同源性分析结果表明,PsPIP2与木薯PIP2同源性最高。5.PsMADS4是从消减文库中分离到的一个在盛花期表达量明显升高的EST。通过RACE-RCR技术扩增获得1081 bp的PsMADS4全长cDNA序列,其中107-844 bp为开放阅读框,总计738 bp,编码245个氨基酸,具有两个保守结构域,其中MADS-box结构域在3-75位氨基酸,K-box结构域在89-176位氨基酸。PsMADS4在拟南芥中的超表达研究表明,转基因拟南芥的开花时间早于野生型,但花期仅略长于野生型拟南芥的花期。