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抗菌肽是机体为抑制有害病原体的侵入而本能的生成的一类小分子蛋白,该蛋白由不同生物体细胞相应的特定基因进行编码,具有广泛的杀菌作用。不仅对细菌有很强的杀伤效果,对真菌也有一定的抑制作用。抗菌肽是一类小分子量的蛋白,较易溶于水,对高温有较强的耐性,在强酸强碱的环境中仍具有抗菌活性。得到抗菌肽的方法有很多,包括溶液浸提、体外合成及分子的表达等。其中以分子水平的基因克隆、表达获得的蛋白量最多,为了更进一步的获得较多量的抗菌肽,本文将对已经进行成功表达的Spinigerin α抗菌肽进行基因的定点突变,以便能够获得抗菌能力更高的抗菌肽。根据已知序列的DNA,基因的定点突变技术可以在其序列之间随意的插入一个或多个碱基,也可以敲除其中的任意的碱基,也可将其中某个或某些碱基换成我们所需要的碱基。现已知常用的定点突变方法有以PCR为媒介的基因突变、以引物做为媒介的基因突变以及盒式基因突变。抗菌肽Spinigerin是白蚁在受到外界病原微生物刺激时,由于白蚁的免疫应答反应而产生的的一种线性的抗菌肽,由25个氨基酸构成,抗菌肽的氨基酸顺序是HVDKKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL (Genbank为：GI:13959577). Spinigerin抗菌肽有6个净电荷数,其疏水结构占总结构的52%,且它的一级结构中没有半胱氨酸,与目前为止发现的其他抗菌肽无同源性,但该抗菌肽的空间构象与抗菌肽Magainin Ⅱ具有很大的相似性。抗菌肽Spinigerin结构中的赖氨酸(4)与苏氨酸(23)之间是一个稳定性很强的α-螺旋结构。本试验室已经成功表达了由这18个aa组成α-螺旋结构的抗菌肽,并证明该抗菌肽具有抗菌活性,本研究室将其命名为Spinigerin α抗菌肽。抗菌肽Spinigerin α亲水端的第一个aa是碱性的赖氨酸(Lys)；抗菌肽疏水端的第一个aa为中性的亮氨酸(Leu)。对抗菌肽Spinigerin α的空间构象进行分析,结合抗菌肽的抑菌机制,利用毕赤酵母对“三联”密码的使用频率对抗菌肽进行定点突变。将亲水性端的碱性Lys分别定点突变为碱性更强的Arg、酸性的Asp、以及中性的Ala；将疏水端的中性Leu定点突变为碱性的Arg、酸性的Asp。将突变体Spinigerin α’的基因按正确阅读框克隆到载体质粒pPICZa-A上,后将重组子经热激法转入至大肠杆菌DH5α中,通过双酶切鉴定、PCR验证以及DNA序列分析,证明所转化的宿主酵母GS115中含有该突变体。采用琼脂孔穴扩散法,以E. coli K12D31、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌作为敏感菌株,对五种突变体的表达液抑菌。结果表明Spinigerin α’-1勺抑菌活性降低,Spinigerin α’-2抑菌活性稍有增加,Spinigerin α’-3的抑菌活性最强,而Spinigerin α’-4,5酵母表达的蛋白无抑菌活性。