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胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的致病菌,该病原能引起猪的纤维素性胸膜炎和出血性肺炎,给世界养猪业带来巨大的经济损失。研究证明胸膜肺炎放线杆菌具有多种毒力因子,包括Apx分泌外毒素、脂多糖、荚膜多糖等。这些毒力因子都是体外培养条件下表达的,对APP体内诱导抗原的研究并不多。体内诱导抗原是病原菌在感染过程中特异表达的抗原,这些抗原在致病过程中发挥着重要作用。鉴定胸膜肺炎防线杆菌体内诱导表达抗原,有利于进一步揭示其感染的机制。本研究运用体内诱导抗原技术筛选到APP的体内诱导抗原,证明这些抗原在感染过程中优先表达。免疫学实验证明APP体内诱导抗原半乳糖代谢相关酶（GalT）能诱导有效的体液免疫和细胞免疫应答,是良好的免疫原。研究证明GalT刺激巨噬细胞能促进促炎性细胞因子的分泌,同时揭示了此过程中的信号转导通路。具体工作如下:1、APP体内诱导抗原GalT的鉴定及转录分析本研究使用运用体内诱导抗原技术（IVIAT）鉴定了APP感染过程中体内特异表达的基因。对筛选结果的测序发现,共筛选到11个体内诱导抗原。对测序结果分析得出,这些基因分别涉及代谢、复制、转录调控和信号转导等细胞功能。此外,本研究还筛选到了3个功能未知的体内诱导抗原。运用荧光定量PCR对体内诱导抗原的表达水平分析显示,与体外培养相比,大部分体内诱导抗原在感染过程中都有不同程度的上调表达。PCR鉴定结果证明体内诱导（In vivo-induced,IVI）抗原广泛分布于APP不同的血清型。IVI抗原在APP感染过程中可能发挥重要作用。2、体内诱导抗原GalT对APP的感染提供免疫保护作用研究本研究对RnhB,GalU,GalT,Apl1061,Apl1166和HflX 6个体内诱导抗原进行了疫苗免疫保护试验。研究结果显示,不同免疫组的IgG水平均显著高于阴性对照组的水平（P<0.001）。除了RnhB,其它5个蛋白均能刺激淋巴细胞的增殖,其中rGalU和rGalT组表现为相对较高水平的刺激增殖活性（P<0.05）。在GalT免疫组,CD4+T细胞的比例显著高于阴性对照组（P<0.05）。此外,其它免疫组CD4+T细胞的含量均表现为不同程度的上调。细胞因子实验显示,不同蛋白均能刺激Th1型（IFN-g,IL-2）和Th2型（IL-4）细胞因子的分泌。免疫保护实验结果显示,蛋白rGalT,rAPL1166和rHflX能够提供较高的保护效率,分别为87.5,62.5和62.5%。其余3个免疫组表现为部分保护,保护效率均为25%。肺脏组织病理学分析结果显示,免疫组存活动物表现为相对正常的肺泡结构。本研究结果证明体内诱导抗原作为候选疫苗对于胸膜肺炎放线杆菌的感染可以提供部分保护。3、GalT对不同血清型的APP感染提供交叉免疫保护研究GalT是胸膜肺炎放线杆菌的一个重要抗原,在之前的研究种证明了其对APP的感染可以提供部分免疫保护。本研究的主要目的是研究GalT对不同血清型APP的保护作用和由GalT抗原刺激引起的免疫反应机理。生物信息学分析证明GalT在APP中为高度保守的基因,同时该基因还在多种病原菌种广泛存在。同源性分析结果显示,不同APP菌株GalT基因的相似性在78.9%到100%之间。间接ELISA结果证明胸膜肺炎放线杆菌L20和MS71全细胞灭活抗原不能诱导GalT特异性抗体的产生。免疫保护试验证明,源于APP L20的GalT重组融合蛋白,对不同血清型APP表现出交叉保护作用,APP血清1型MS71（50%,4/8）和APP血清5b型L20（75%,6/8）。组织病理学分析结果显示,与阴性对照组相比较,重组GalT蛋白免疫动物的肺组织表现出较轻微的病理变化。免疫组织化学分析结果显示,与正常对照组相比,APP感染组中性粒细胞浸润水平显著升高（P<0.001）;同时免疫组存活动物的中性粒细胞浸润水平显著低于阴性对照组。调理吞噬实验证明了GalT抗血清能促进中性粒细胞对APP的吞噬作用。在GalT抗血清的作用下,APP的存活率与阴性对照组相比显著降低（P<0.001）。本研究证明GalT是一种有效的交叉保护抗原,可作为对不同APP血清型的有交叉保护的候选疫苗进一步研究。4、APP体内诱导抗原GalT促炎功能研究GalT在革兰氏阴性菌中保守存在,研究证明其在病原菌的致病机理中发挥重要作用。APP属于巴氏杆菌科,是一种重要的呼吸系统病原菌。GalT在APP感染过程中的作用机理仍不清楚。本研究旨在分析GalT在APP感染发病机理中的作用。本研究首先重组表达了GalT蛋白,经过去内毒素处理,可作用于Raw264.7巨噬细胞系。研究结果表明,重组GalT蛋白刺激巨噬细胞Raw264.7,能够诱导促炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌。与阴性对照组比较,GalT能显著提高巨噬细胞分泌促炎性细胞因子（P<0.05）。此外,抑制剂实验表明GalT通过P38和JNK MAPKs信号通路调节促炎性细胞因子的产生。同时,免疫印迹显示GalT刺激P38,ERK1/2和JNK MAPKs信号通路,该过程包括P38,ERK1/2,JNK MAPKs途径和NF-κB途径。TLR2和TLR4均参与了GalT的诱导过程,然而在诱导促炎性细胞因子过程中这两个受体分别正调控和负调控作用。本研究证明,GalT能诱导巨噬细胞分泌促炎性细胞因子,该过程为TLR-2和TLR-4依赖性,同时涉及P38,ERK1/2和JNK MAPKs信号通路。