论文部分内容阅读
[目的]微小RNA(microRNA, miRNA)是一类非编码调控单链小分子RNA。他们代表了一类重要的新的生物调控分子,在许多生物学过程中有着很重要的作用,包括生长、分化、凋亡、病毒感染和癌症发展。宫颈癌是全球女性的常见肿瘤之一,其发生和发展是多基因共同参与,多步骤完成的复杂过程。前期工作利用寡核苷酸微阵列技术检测了宫颈癌组织及其对应正常宫颈组织中miRNA的表达谱差异,发现miR-19a、miR-19b在宫颈癌中高表达。本研究应用Real-time PCR技术验证了这一结果,然后研究了miR-19a和miR-19b对宫颈癌细胞生长表型的影响,进一步确定miR-19a、miR-19b直接作用的共同靶基因,并寻找miR-19a和miR-19b对宫颈癌发生和发展的分子机制。[方法]首先,我们应用Real time PCR技术检测miR-19a、miR-19b在人类宫颈癌组织和癌旁正常组织中的差异表达。用WST-1,集落形成实验和细胞生长曲线等检测miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞系HeLa和C33A的生长活性的影响。我们用生物信息学方法预测和筛选了miR-19a和miR-19b的候选靶基因CUL5,并且用荧光报告载体实验验证了miR-19a和miR-19b对CUL5的直接调控作用。通过Real time PCR技术和Western blot方法在宫颈癌细胞系中检测miR-19a和miR-19b对CUL5的mRNA和蛋白水平的影响。最后利用挽救实验过表达CUL5和RNA干扰技术沉默CUL5后,用WST-1实验、生长曲线实验、集落形成实验和Transwell实验检测了细胞表型的变化,进一步研究靶基因的功能。[结果]Real time PCR结果显示,与正常宫颈癌组织相比,癌组织内miR-19a和miR-19b的表达明显升高,而CUL5的mRNA和蛋白水平明显降低。Real timePCR和Western blot的结果表明miR-19a和miR-19b能够影响CUL5mRNA和蛋白的表达水平。过表达miR-19a和miR-19b,宫颈癌细胞的增殖能力,侵袭能力和生长能力均增强了,然而封闭miR-19a和miR-19b后,通过诱导CUL5的表达,使得宫颈癌细胞的侵袭,增殖和生长能力受到抑制。荧光报告载体实验表明,miR-19a和miR-19b能够通过作用于CUL5基因的3’非翻译区(3’UTR)的特定位点,对其表达进行负性调节。在宫颈癌细胞中,挽救CUL5与封闭miR-19a和miR-19b对细胞的表型影响一致,而沉默CUL5后与过表达miR-19a和miR-19b对细胞的表型影响一致。[结论]miR-19a、miR-19b是起到癌基因的作用。在宫颈癌细胞中通过对其靶基因CUL5的表达,从而调节细胞的生长、增殖和侵袭。通过阐明miR-19a、 miR-19b在宫颈癌中的具体作用机制及靶基因的研究有利于我们对宫颈癌的发生和发展进行深入的了解,同时也为肿瘤的诊断和治疗提供新依据。