植物在其整个生长发育的生命周期中面临着各种不利的外部环境,其中,低温是限制植物生长与分布的重要的环境因素之一,严重影响植物的生长发育。利用基因工程对作物进行遗传改良提高其抗逆性,是保障作物高产、优质和安全生产的有效途径,大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。本研究选择较耐寒的苹果砧木品种Mailing26(M.26),利用Solexa高通量测序技术对冷处理的幼苗进行转录组测序分析,筛选出表达量显著变化的基因,对这些基因进行生物信息学分析和注释,从中寻找新的抗寒基因,为深入阐明植物耐寒性分子机理提供更多的依据。主要实验结果如下：(1)在确定M.26抗寒性敏感时间点的基础上,对冷胁迫处理后的样本进行转录组测序。电导率和丙二醛含量分别是检测细胞膜受损程度和衡量膜脂过氧化程度的指标。测定冷处理幼苗叶片的电导率与丙二醛含量,对比M.26与苹果栽培品种Gala抗寒性的差异,确定1h和6h可作为M.26抗寒性敏感时间点。4℃C冷处理M.26叶片后,提取RNA用于Solexa测序,0h、1h和6h冷处理的三个样品分别获得318576、300676和640732个特异性标签。排除假阳性标签、比对苹果基因组并拼接组装后得到了14219、11176和16116个有效基因。(2)表达谱中差异表达的基因筛选及功能分析。设置差异倍数大于等于4(log2差异倍数|=2)为差异基因的筛选标准,1h与0h相比,得到139个上调基因和1499个下调的基因；6h与1h相比,获得1085个上调基因和381个下调基因,其中约40%的差异基因为未知基因。GO功能分类和KEGG Pathway分析表明差异基因参与多种通路,涉及16类细胞组分的变化包括质体、细胞质、细胞核等,10类分子功能的变化包括转录因子、抗氧化物、信号传感器、酶调节物等,13类生化途径包括代谢调控、信号转导、胁迫响应、基因表达等,这些组分及调节的生化反应在植物适应冷胁迫的过程中发挥着重要的调节作用。(3)实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析验证表达谱的可靠性。随机挑选6个上调基因和5个下调基因,设计特异性引物。对M.26叶片用前述相同的方法进行冷胁迫处理,提取RNA后,利用qRT-PCR检测这11个基因的相对表达量并与表达谱结果对比,qRT-PCR所得结果与表达谱中11个基因表达量的变化趋势一致,表明表达谱的结果是可靠的。(4)克隆得到新抗逆基因,分析其编码蛋白MdTLP7(Tubby-like protein7)的结构特征。从冷胁迫差异基因表达谱中,我们发现了一个动物肥胖基因(Tubby)同源物,该基因的表达量在4℃冷处理6h时显著上调表达,暗示着它在植物非生物胁迫中起重要作用。从苹果的cDNA文库中我们克隆得到了该基因,其编码区长度1245-bp,编码含415个氨基酸的蛋白质,我们称之为MdrLP7。与动物TLP蛋白只有Tubby结构域不同,MdTLP7从N-端到C-端由前导肽、F-box结构域和Tubby结构域组成。(5)MdTLP7抗逆功能鉴定。构建原核表达载体,将MdTLP7转入大肠杆菌。在固体和液体培养下对大肠杆菌细胞分别进行4℃、50℃、0.5M NaCl和0.5M KCl胁迫处理,检测MdTLP7重组表达对细胞生长的影响,结果显示,上述胁迫条件下,包含MdTLP7重组质粒的菌株其存活率和生长速率都明显高于对照菌株,表明MdTLP7的表达显著增强了原核细胞抵抗盐与温度胁迫的能力。(6)MdrLP7功能区域分析。根据MdTLP7的结构特点,分别从N-末端和C-末端设计系列缺失突变体,重组表达后结果表明,缺失前导肽与F-box结构域后,MdTLP7抗逆功能与野生型相比没有明显变化,而Tubby结构域的缺失显著降低了MdTLP7的抗逆能力,在120-415氨基酸片段的Tubby结构域中,120-310氨基酸片段对MdTLP7的抗逆能力作用最重要。三维模拟Tubby结构域,由一个β桶包围中心的α螺旋组成,120-310氨基酸片段组成β桶部分结构,说明Tubby结构域的β桶结构对该蛋白的抗逆功能起关键作用,而C-末端的α螺旋作用较小。