蓖麻毒素(Ricin Toxin，RT)是从大戟科植物蓖麻(ricinus commnnis)的种子中提取的一种毒性蛋白，具有强烈的细胞毒性。它由A和B两条多肽链组成，其间通过二硫键相连接。A链是活性链，具有N-糖苷酶活性，可催化切断真核生物60S亚基28S rRNA中第4324位腺嘌呤与核糖分子之间的糖苷键，使其脱去一个腺嘌呤，使核糖体60S亚基失活，从而抑制蛋白质的合成。B链具有凝集素活性，其本身几乎没有毒性，主要作用就是识别和结合细胞表面末端含有半乳糖基结构的受体，并协助A链进入细胞内。蓖麻毒素具有强烈的细胞毒性，具有抗肿瘤的应用前景。但由于蓖麻毒素细胞杀伤作用本身不具有选择性，所以它除了具有抗肿瘤的活性外，对正常细胞也有杀伤作用，因而妨碍了其在临床上的应用。近年来，蓖麻毒A链可以与单克隆抗体相交联而制备免疫毒素(Immunotoxin，IT)，免疫毒素既具有强大的肿瘤杀伤作用，同时又有抗体的特异性，可以将毒素分子靶向运送到肿瘤细胞，以减少对正常细胞的损伤。目前，已有多种免疫毒素进入临床试验，尽管尚有些副反应有待解决，但其作为肿瘤治疗的方向，值得进一步的探索。蓖麻毒素A链在大肠杆菌中表达，因无糖基化修饰，克服了进入体内后被迅速降解的缺点，为进一步与单链抗体基因嵌合表达形成单链免疫毒素，对肿瘤细胞进行导向治疗研究奠定基础。 本论文旨在研究蓖麻毒素A链蛋白(RTA)及其修饰体RTA-KDEL(内质网保留信号肽)在大肠杆菌中的表达。并通过两种蛋白对不同细胞的杀伤作用的比较，为进一步制成杀伤作用更强、治疗效果更好的免疫毒素，以对肿瘤细胞进行导向治疗研究奠定基础。RTA和RTA-KDEL表达质粒的构建，由詹金彪于1998年完成。简言之，以质粒pGEM3zf(-)-RTA为模板，PCR扩增出RTA-KDEL的DNA序列，PCR产物直接亚克隆至pT7BlueT载体。克隆产物经序列测定证实后，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对亚克隆产物进行双酶切，所得目的基因浙江大学硕士学位论文陈永对与同样经EcoRI和Hindm双酶切的pKK223.3载体连接，构建重组质粒pKK223.3一Rl’A一KDEL。把重组质粒转化入大肠杆菌JM109中，挑取转化成功的单克隆菌，接种到含Amp的LB培养基中，于37℃振摇过夜。以2%比例接种入新鲜Mg培养基，培养至对数中期，加入IPTG至终浓度为1 mM，在温度为30℃的条件下诱导表达3小时。为了摸索出蛋白表达时的最佳条件，首先分别在不同的温度下(22℃、30℃、37℃)诱导表达相同的时间，以得到最适表达温度。然后在最适表达温度下，诱导表达不同的时间(l小时、3小时、5小时)，以摸索出蛋白表达的最佳时间。表达出的蛋白经超声破碎后，取其上清。上清液过Blue一sepharose 6B柱，进行一步亲和层析，得到纯化的RTA和PJ人~KDEL重组蛋白。以此两种蛋白与不同的细胞株(Hela细胞、人乳腺癌细胞MCF一7、人脐血管内皮细胞ECV-304细胞)进行共培养，采用M仃法测定它们对不同的细胞株的杀伤作用。 通过本实验，可以得到以下结论:(1)、以PCR方法，成功地构建了重组质粒pKK223.3~Rl’A~KDEL。(2)、经正TG诱导后，转化子E.cozi BLZI印KK223.3一Rl’A一KDEL)中出现了一条分子量约为31，000大小的条带，与预期的蛋白质分子量相符。而作为对照的未诱导菌液中则没有此分子量的浓带。(3)、通过对蛋白表达时的最佳条件的摸索可知，在30℃、诱导表达5小时时，细菌产生的可溶性RTA蛋白较多，而RLA~KDEL蛋白则在30℃、诱导表达3小时的条件下，可溶性较好。(4)、通过诱导表达产生的蛋白质，经过Blue一sePharose 6B一步亲和纯化，SDS一PAGE检查看出，只有一条分子量约为31 000大小的条带，表明纯化完全。(5)、以MIT法测定Rl’A和Rl’A~KDEL蛋白对不同细胞的毒性作用，结果表明Rl’A~KDEL比RTA本身对不同细胞株的杀伤作用更强。提示:加内质网保留信号肤KDEL可以改变Rl’A在细胞转运和转位途径，RTA一KDEL与单克隆抗体结合可以形成毒性更强的免疫毒素。