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线粒体在急性缺血性卒中患者出现的脑缺血再灌注损伤发生发展的过程中发挥了重要作用。目前研究已经发现,线粒体损伤程度与脑神经细胞的状态密切相关。随着研究深入,人们对线粒体的功能及其调控网络有了更加深入的了解,尤其是线粒体功能代偿作用机制的提出为探究线粒体在脑缺血再灌注损伤中的作用提供了新的理论与实验基础。去乙酰化酶SIRT3和转录共激活因子PGC1α被认为是调控线粒体质量及生物发生的重要蛋白分子之一,通过调控ATP生成、ROS量及抗氧化相关酶类,发挥保护线粒体的作用。这种作用可以体现在线粒体内的分子伴侣如HSP10、HSP60及LONP等蛋白酶体,通过线粒体未折叠蛋白反应（mtUPR）清除受损的错误折叠蛋白,从而使线粒体功能发挥了部分代偿作用,减轻了细胞损伤。人们将这种拮抗线粒体损伤的适应性反应称之为线粒体适应性重组（AMR）。虽然人们发现,缺血再灌注等损伤时,UCP2、NAD+/NADH、SIRT3-PGC1α可能与线粒体适应性重组有关。我们的前期工作发现,当给予C57BL/6J小鼠腹腔注射京尼平（Genipin）一种UCP2抑制剂后,又可通过UCP2-SIRT3调节减轻缺血再灌注损伤,这些研究结果提示UCP2可能和mtUPR反应有关。因此,进一步研究线粒体损伤时UCP2及SIRT3-PGC1α信号途径的变化,可能为探讨线粒体适应性重组在脑神经细胞损伤中的作用提供新的理论依据。HtrA2/Omi是位于线粒体膜间隙的丝氨酸蛋白酶,已经发现HtrA2/Omi功能下降与帕金森、阿尔兹海默症等疾病有关。并且,已有实验结果显示HtrA2/Omi基因突变纯合子(HtrA2mnd2)小鼠早期就会出现神经退行性疾病症状。因此,本实验利用HtrA2/Omi基因突变小鼠,首先观察线粒体功能与神经细胞损伤的关系;其次,利用野生型（WT）及HtrA2/Omi基因突变杂合子(HtrA2 Hetero)复制IRI模型,探讨杂合子缺血再灌注后UCP2-SIRT3-PGC1α活性变化及对线粒体质量和功能影响;最后,使用Genipin腹腔注射预处理再复制缺血再灌注模型,阐述UCP2通过SIRT3-PGC1α途径调控线粒体适应性重组的具体机制。通过靶向UCP2,观察SIRT3-PGC1α信号途径的改变,进一步探讨蛋白酶HtrA2/Omi在神经细胞中的作用。方法:1、以HtrA2/Omi基因突变杂合子HtrA2Hetero、纯合子HtrA2mnd2小鼠为实验对象,在观察小鼠生理学指标变化的同时,应用Western Blot、qPCR、PCR array、免疫组化、透射电镜、酶活性试剂盒等技术评估线粒体质量控制水平及线粒体功能。2、利用WT及杂合子HtrA2Hetero复制MCAO模型,通过TTC染色、Western Blot、PCR array、免疫组化、多种试剂盒等检测线粒体质功能指标,评估线粒体功能与HtrA2Hetero脑神经细胞的损伤及UCP2-SIRT3-PGC1α途径的活性改变。3、腹腔注射UCP2抑制剂Genipin,比较观察WT及HtrA2Hetero MCAO模型TTC染色结果,并通过免疫组化、Western Blot、透射电镜、酶活性试剂盒等技术,分析HtrA2/Omi可能通过UCP2-SIRT3-PGC1α途径调控线粒体适应性重组的潜在机制。结果:1、HtrA2/Omi基因突变纯合子HtrA2mnd2早期生长停滞并死亡,HtrA2/Omi基因突变杂合子HtrA2Hetero早于WT出现褪毛迹象。而HtrA2 Hetero脑皮质HtrA2/Omi蛋白及mRNA水平表达增加。HE染色及TUNEL染色显示HtrA2mnd2细胞数目明显减少,细胞皱缩,排列紊乱,凋亡细胞核数目显著增多,HtrA2Hetero次之。2、HtrA2Hetero大脑皮质SOD活性增强,MDA含量下降,ATP含量升高;线粒体UPR相关蛋白表达增多,mtDNA拷贝数及线粒体数量增多;UCP2蛋白表达升高的同时NAD+/NADH比值及SIRT3活性明显增强,HtrA2mnd2显著下降。3、HtrA2Hetero缺血1.5h再灌注24h损伤后,TTC染色脑梗死面积明显增多。HE染色显示细胞损伤的加重及TUNEL染色提示凋亡细胞核数量增多。HtrA2/Omi蛋白表达降低同时,SOD活性减弱,MDA含量增多,ATP含量下降,HSP10、HSP60、LONP质量控制相关蛋白表达明显下。UCP2表达的增强并未引起下游SIRT3-PGC1α活性增强。4、给予Genipin预处理后复制MCAO模型,TTC染色显示梗死面积降低。HtrA2Hetero模型组LONP表达、ATP含量、mtDNA拷贝数,呼吸量复合体I活性显著增高。UCP2蛋白表达没有明显升高的同时保持HtrA2/Omi蛋白表达,NAD+/NADH比值及SIRT3活性显著升高,PGC1α表达增加。结论:1、脑皮质组织形态学、TUNEL染色等结果显示,HtrA2/Omi基因突变纯合子HtrA2mnd2鼠脑组织损伤较较杂合子HtrA2Hetero加重,蛋白酶HtrA2/Omi功能下降程度与脑组织损伤密切相关。2、HtrA2/Omi基因突变杂合子HtrA2Hetero脑皮质HtrA2/Omi表达增多同时,也伴随SIRT3、PGC1α表达增多,这提示HtrA2/Omi与SIRT3、PGC1α密切相关。结合质量控制相关蛋白HSP10、HSP60、LONP表达增多,表明与纯合子HtrA2mnd2相比,杂合子HtrA2Hetero可能是通过SIRT3-PGC1α途径引起适应性线粒体重组,部分拮抗了HtrA2/Omi功能下降导致的脑神经细胞线粒体损伤。3、HtrA2/Omi基因突变杂合子HtrA2Hetero缺血再灌注损伤后脑梗死面积明显增多,同时HSP10、HSP60、LONP质量控制相关蛋白表达明显下降。表明HtrA2/Omi功能下降时,缺血再灌注损伤能够引起SIRT3-PGC1α途径下调,导致线粒体适应性重组功能下降。4、Genipin预处理后梗死面积下降,同时杂合子HtrA2Hetero缺血再灌注后HtrA2/Omi及LONP表达部分恢复,呼吸链复合体I活性增强,ATP合成增加。提示Genipin可能通过UCP2和/或蛋白酶HtrA2/Omi激活下游SIRT3-PGC1α,从而减轻HtrA2/Omi功能下降时,缺血再灌注引起的脑神经细胞损伤。