论文部分内容阅读
研究背景在哺乳动物中存在多种损伤修复系统，包括碱基切除修复（base excisionrepair，BER）通路、核酸切除修复（Nucleotides Excision Repair，NER）通路、同源染色体重组修复（Homologous Recombination Repair，HR）及非同源末端结合（Non-Homologous End Joining，NHEJ）修复通路。其中BER是DNA损伤的主要修复系统。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（apurinic/apyrimidinic endonuclease1,APE1）是BER途径的主要限速酶，通过切除受损DNA产生的AP位点来发挥作用。作为DNA损伤修复相关基因，其突变导致的蛋白功能缺失将引起细胞癌变，最终导致肿瘤发生。研究发现，APE1基因突变与前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌的发生密切相关。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（poly(ADP-ribose) polymerase1，PARP-1）是在高等真核细胞中广泛表达的核酶，参与DNA单链及双链损伤修复。乳腺癌易感基因（BRCA1）在乳腺癌的发生发展中起重要作用。当BRCA1缺陷时，PARP-1的功能对双链断裂修复有着重要的意义。除此之外，PARP-1还可以通过DNA聚合酶（polβ）、DNA连接酶Ⅰ、DNA连接酶Ⅲ/X线交叉互补修复基因（X-ray cross-species complimenting1,XRCC1）XRCC1等介导长补丁BER途径。前期研究发现，PARP-1抑制剂——olaparib可使BRCA1突变的细胞选择性凋亡，但Ⅱ期临床研究却发现，单用奥拉帕尼治疗，有效率仅为41%。鉴于APE1在DNA损伤修复中的重要作用，本实验研究了APE1的表达与乳腺癌患者病理学特征的相关性。同时作出猜想：APE1可能是BER途径的另一条重要旁路，其介导的BER途径的激活可能是PARP-1抑制剂靶向治疗三阴性乳腺癌敏感性不高的重要原因。第一部分乳腺癌组织及细胞中APE1的表达水平及临床意义目的：通过检测乳腺癌组织及细胞中APE1的表达，探讨APE1的表达水平与乳腺癌临床病理参数之间的相关性。方法：收集256例乳腺癌组织及73例非乳腺癌组织（癌旁），制作成组织芯片，利用免疫组织化学方法检测APE1蛋白在组织中的表达，并结合临床病理参数探讨其临床意义。蛋白质免疫印记杂交法检测五株不同类型乳腺癌细胞中APE1蛋白的表达情况。结果：APE1蛋白的阳性表达率在乳腺癌组织中明显高于癌旁组织（p＜0.001）；在ER阴性患者中明显高于ER阳性者（p=0.022）；在HER-2阳性患者中明显高于HER-2阴性者（p=0.019）；在三阴类型中明显高于非三阴型（p=0.036）。APE1阴性表达者的总生存期明显长于阳性者。在乳腺癌细胞中APE1的表达均高于正常乳腺细胞，除了三阴性乳腺癌细胞， HER-2阳性的两株细胞中APE1表达均较高。结论：APE1蛋白的表达在乳腺癌组织及癌旁组织中存在明显差异，且在不同ER、HER-2状态，不同分子表型患者中也存在差异。APE1阴性表达者总生存时间长，APE1表达状态为乳腺癌患者的独立预后因素。APE1在乳腺癌细胞中的表达水平明显高于正常乳腺细胞，且与三阴表型密切相关。表明APE1是一种癌基因，检测APE1的表达水平对乳腺癌，特别是三阴乳腺癌的预后判断有一定的指导意义。第二部分PARP-1抑制剂Olaparib对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响目的：奥拉帕尼处理后检测其对各乳腺癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法：设置不同的浓度梯度及时间，奥拉帕尼分别处理正常乳腺细胞（MCF-10A）及乳腺癌细胞株（MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、ZR-75-30、T47D），利用MTT及流式细胞技术检测药物对各细胞株的抑制增殖及凋亡作用。结果：奥拉帕尼对不同类型乳腺细胞株的IC50值的范围为11.206~32.164μM，对正常乳腺细胞的IC50值大于100μM。在浓度为50μM，处理48h时，流式细胞技术检测各细胞株的凋亡率为13.4%~95.74%。结论：奥拉帕尼对不同类型乳腺癌细胞株的敏感性有所差异，对Her-2过表达型及三阴型较为敏感。第三部分奥拉帕尼对MDA-MB-231中APE1表达的影响及RNAi技术敲低APE1方法的建立目的：通过免疫蛋白印迹法检测经奥拉帕尼处理后MDA-MB-231细胞中APE1的表达水平；RNAi技术敲低MDA-MB-231细胞中APE1表达。方法：根据第二部分实验中所得的IC50值及最佳作用时间，利用免疫蛋白印迹法检测奥拉帕尼对MDA-MB-231细胞中APE1蛋白表达水平的影响；利用MLP-shRNA-APE1质粒载体转染MDA-MB-231细胞，荧光显微镜观察绿色荧光，免疫蛋白印迹法检测敲低效率。结果：经奥拉帕尼处理后的三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，其APE1表达水平较未处理组升高；利用MLP-shRNA-APE1质粒载体感染MDA-MB-231细胞36~48h，荧光显微镜观察转染效率约为60~70%，Western blot检测APE1基因表达较未感染细胞明显降低。结论：奥拉帕尼可增加BRCA1/2突变的三阴乳腺癌细胞中APE1的表达；利用RNAi技术可显著敲低MDA-MB-231细胞中APE1的表达水平。