第一部分摘要东南亚型(--SEA) a地中海贫血是世界上常见的人类单基因遗传病之一,主要集中在东南亚及我国广西、广东和海南三省。其基因携带率达到4.5%-14%,是造成重症α地贫(Bart’s水肿胎和Hb H病)的主要类型。通过基因检测筛查适龄人群中(--SEA)缺失型α地贫基因携带者是实现预防地贫的有效手段。但是基因检测需要特殊仪器设备及技术培训,且检测费用高,难以在基层医院普及,从而限制了地贫基因携带者的大规模筛查。Zeta珠蛋白链是胚胎期特有的血红蛋白成分,在出生3个月后不再被检出。1988年,Chui等发现(--SEA)缺失型α地中海贫血的基因携带者的成人血红蛋白中仍可检出微量的zeta链,从而开辟了一条筛查α地贫的新途径。目前目前检测zeta链的主要方法包括反向高效液相层析(RHPLC),免疫细胞化学(immunocytochemistry)及酶联免疫吸附测定(ELISA)。其中ELISA法特异敏感、操作简便,可进行高通量检测。本实验室已成功研制出国内第一个双抗体夹心ELISA试剂盒,并已应用于临床和大规模筛查。然而ELISA由于需要特殊的仪器设备,专业的技术人员,历时约2h的检测时间,使其在个性化检测和现场筛查中的应用受到限制。因此,研究和开发更加简单快速,适用于高通量和个性化检测的新技术势在必行,这也是本课题研究的目的。免疫层析法(ICA)操作简单快速、成本低,只需肉眼判断或简单仪器便可判读结果,适用于个体化和现场大规模检测。目前,ICA已广泛用于疾病或违禁添加物的定性或半定量检测。免疫层析技术常见的标记物有胶体金、磷光微粒、乳胶、明胶等,其中运用最普遍的标记物是胶体金,已成功应用于筛检和监测多种物质,包括抗生素、病原体和药物。但胶体金免疫层析法用于检测血液红细胞裂解标本时,血红蛋白的红色背景则会对胶体金颗粒形成的反应线造成干扰,因胶体金颗粒多为红色或橙红,个别为蓝灰,从而影响结果判读,这也是至今无检测血红蛋白的免疫层析试纸条的主要原因之一。为解决血红蛋白在ICA检测中红色背景的干扰,并保证较理想的灵敏度,本课题使用荧光乳胶微粒代替胶体金作为标记物,建立了检测zeta链的荧光微球免疫层析试纸条(FL-ICA)。该检测体系简单快速,检测器为市售验钞笔,在10min之内即可显示结果。以分子生物学基因诊断为金标准进行核准,运用本体系及双抗体夹心ELISA检测314份血液样本,结果显示本体系的特异性为100%,灵敏度为98.0%,而ELISA的为100%,99.2%,提示本实验建立的免疫荧光试纸条体系具有良好的灵敏度和特异性。一、免疫层析试纸条基本组成及荧光ICA建立层析试纸条的基本组成主要由样品垫、带有荧光微球标记单抗3H9的结合垫、分别包被了兔抗鼠IgG和单抗4D11作为质控C线和检测T线的硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸这四个基本部分组成。免疫层析试纸条的结果判断检测过程中,用最佳激发光源对滞留硝酸纤维素膜的反应线的荧光微球标记物进行激发,根据NC膜的条带显示情况来判断检测结果。只有质控C线显色,为阴性结果；质控C线和检测T线均显色,为阳性结果；质控C线若不显色,则该试纸条无效。二、荧光ICA体系的条件优化根据本实验室已建立并获得国家批文的双单抗夹心ELISA体系,在荧光免疫层析试纸条中,仍以单抗4D11作为捕获抗体,荧光微球标记3H9为检测抗体。主要根据以下3个方面的标准进行免疫层析试纸条的条件优化：①血液样本滴加到样品垫后跑样是否顺畅均匀；②结合垫荧光标记单抗释放是否理想；③NC膜质控C线和检测T线显色是否正确明亮。最终确定条件为：采用粒径为100nm的荧光微球作为标记物,按照每毫克荧光微球标记25ug抗zeta链单抗3H9的比例进行标记；每厘米聚酯纤维膜喷涂6ul FL-3H9的比例,用浸泡的方法将FL-3H9固化到结合垫上；NC膜上检测T线的划线浓度为3mg/ml时,有利于避免假阴性和假阳性；血液标本先用ddH20充分裂解后,再用含脱脂奶粉的生理盐水稀释,可有效减少假阳性和假阴性的发生。三、荧光免疫层析试纸条在zeta链检测中的应用将经过优化的各组成部分——样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸组装成试纸条,用于检测正常血液标本和(_SEA)缺失型α地贫基因携带者。结果显示,检测正常血液只有质控C线显色,为阴性结果；检测携带者血液标本时,质控C线和检测T线均显色,为阳性结果。经过实验证明,本研究建立的荧光免疫层析试纸条具有良好的敏感性,(--SEA)缺失型α地贫基因携带者血液稀释度达到1250倍时,FL-ICA仍可检测出阳性。用试纸条和双抗夹心ELISA同时检测314份血液标本,同时以分子生物学诊断作为金标准进行核准。两种免疫学方法的特异性均为100%,灵敏度FL-ICA为98%,ELISA为99%,该结果提示我们建立的荧光微球免疫层析试纸条具有良好的特异性和灵敏度,符合临床检测要求。第二部分摘要免疫球蛋白(Ig)是重要的免疫分子,经典的免疫学理论认为其来源为B淋巴细胞。2003年,邱晓彦教授在Cancer research上发文首报上皮来源肿瘤也可产生Ig分子。其工作在基因水平和蛋白水平上证明一些非免疫细胞,如上皮来源的多种肿瘤细胞及部分正常的上皮细胞也可以表达Ig分子,成为非B细胞来源Ig(non-Ig)。此观点已逐步得到国内外学者的认同,并且陆续有研究证明,non-Ig不仅在多种肿瘤细胞中存在,而且在肿瘤恶化、迁移和增殖中具有重要作用。2008年,Lee发现肿瘤细胞来源的IgG重链成份(CA215)和正常的人IgG高度同源,在其重链可变区存在一段特殊的糖基表位(CA215C),该表位可被单克隆抗体RP215特异性识别。其工作证明了在卵巢癌、宫颈癌、结肠癌等多种肿瘤组织和病人血清中,CA215检测呈阳性；用其特异性单抗RP215处理,不仅能抑制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡,还可以有效抑制裸鼠体内的肿瘤增长。因此,作为一种泛肿瘤标志,CA215可作为肿瘤诊断和治疗的新靶点。目前Lee已将单抗RP215进行人源化以作为治疗用抗体。而以CA215为靶点进行免疫治疗的另一途径是治疗性肿瘤疫苗。然而,由于CA215是非蛋白抗原的糖基表位,属于非胸腺依赖抗原(TI抗原),免疫原性弱,难以诱导再次抗体应答,且不能诱导特异性细胞免疫,这就限制了CA215C直接成为疫苗候选靶点的可能性。本课题的主要研究思路是：利用Lee提供的单抗RP215从噬菌体展示随机肽库中筛选可模拟CA215的特殊糖基表位CA215C的短肽,将其非蛋白抗原表位的性质改变为短肽,进而制备短肽-载体蛋白交联物或多价抗原肽(MAP),从而将TI抗原改变为TD抗原,目的在于诱导机体内产生有效的再次抗体应答和保护性免疫。我们用单抗RP215从噬菌体12肽随机展示肽库中筛选了数十个模拟位克隆,最终选择了三个模拟CA215C表位的序列合成短肽,制备了短肽-BSA载体交联物,免疫接种所获的小鼠抗血清体能有效识别CA215,并且和人正常IgG不结合,即模拟肽可能成功模拟了CA215C的抗原表位。一、应用噬菌体展示技术筛选CA215C模拟肽克隆可结合单抗RP215并模拟CA215C表位克隆的筛选RP215(ATCC HB-10095)由加拿大哥伦比亚大学Lee教授提供,该单抗经鉴定可结合肿瘤细胞来源的CA215C,以该单抗为钓饵分子从噬菌体线性12肽随机展示肽库筛选可与抗体结合,即模拟CA215C表位的噬菌体克隆。对噬菌体12肽库进行了3轮筛选后,从第三轮洗脱产物中随机挑选50个噬菌体克隆,用夹心ELISA鉴定,单抗PR215作为捕获抗体包被酶标板,并以无关对照排除非特异吸板序列,得到33个可以和RP215结合的阳性克隆。阳性噬菌体测序及序列分析在上述33个阳性噬菌体克隆中挑选30个进行DNA测序,并对其氨基酸序列进行分析,最终得到5组保守序列特征。其中,第1、2、5、6、11、31号克隆具有保守序列Ⅰ:E-LWR;第4、12、25、36号克隆具有保守序列Ⅱ:E-HWR;第18、21、39号克隆具有保守序列Ⅲ:E-WR;第3、40号克隆具有保守序列Ⅳ:EDLW;:第7、42号克隆具有保守序列Ⅴ:E-LW.其中I、II、III这3组序列均含有E-(-)wR；I.IV.V这3组序列均含有E-(-)LW.二、模拟肽的合成及抗原性鉴定模拟肽序列优势选择为了在5组保守序列组共17个短肽序列中选择出优势序列,通过包被不同浓度的RP215检测不同保守序列组的代表性样本,以及包被低浓度的RP215检测同一保守序列组的不同样本,最终选择和RP215亲和力较好的保守序列I中的No.2、保守序列V中的No.42以及无规律序列组中的NO.13序列短肽进行了合成。模拟肽的抗原性鉴定体外ELISA鉴定结果表明,以生物素标记的3种线性模拟肽R2,R13,R42中,R2和R42能够特异性结合抗CA215C单抗RP215,而R13与RP215无明显结合；竞争抑制实验结果显示,R2和R42均能剂量依赖性地抑制相应噬菌体2号和42号与RP215的结合,抑制效果可达到70%以上。上述结果提示,R13线性肽未能模拟CA215C表位的抗原性,而R2和R42线性肽模拟了相应噬菌体中与RP215结合的保守短肽序列,并可能模拟了CA215C的某一抗原性表位。三、模拟肽的免疫原性评价不同载体的模拟肽交联物的特异性鉴定将2种合成模拟肽R2/R42分别与鼠IgG(模拟肽-mIgG)和BSA作为载体制备交联(模拟肽-BSA)抗原,鉴定其与RP215、羊抗人IgG多抗的结合。实验结果显示,R2/R42和鼠IgG交联后,交联物不仅可以和RP215结合,也能和羊抗人IgG结合；而R2/R42和BSA交联后,交联物均不能羊抗人IgG结合,但仍然可以和RP215结合。提示模拟肽和鼠IgG交联后,可能形成了和人正常IgG的交叉表位；而模拟肽R2/R42和BSA交联后,仍保留了与RP215结合的表位,并且和人正常IgG没有交叉表位。以模拟肽-BSA交联物的免疫原性评价以BSA为载体的2种模拟肽交联物与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,小鼠的抗血清可以和CA215结合,并且和人正常IgG没有交叉反应；另外,抗血清能有效抑制CA215和RP215的结合。结果提示,抗血清含有针对CA215C的抗体,合成肽可能模拟了CA215C上的某一抗原表位。